小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞的最佳模型之一，因?yàn)樵摷?xì)胞能夠進(jìn)行胞飲和吞噬作用，在炎癥、免疫、凋亡、腫瘤研究應(yīng)用廣泛。RAW264.7細(xì)胞在體外可以對(duì)刺激產(chǎn)生反應(yīng)，并隨后產(chǎn)生具有破骨細(xì)胞完全分化的特征的多核細(xì)胞，被廣泛用于研究骨骼疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)溶解、牙周炎等。

RAW264.7細(xì)胞系的應(yīng)用：

RAW264.7是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。RAW264.7是破骨細(xì)胞、炎癥研究最常用的體外模型之一。

破骨細(xì)胞生成研究：RAW264.7已被證明在RANKL誘導(dǎo)下容易分化為破骨細(xì)胞。與原發(fā)性破骨細(xì)胞前體不同，RAW264.7的分化無(wú)需添加巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）。

炎癥研究: RAW264.7是篩選抗炎活性物和研究炎癥最常用的體外研究模型。在誘導(dǎo)劑（如脂多糖LPS）的作用下，RAW264.7細(xì)胞會(huì)模擬炎癥反應(yīng)，釋放或上調(diào)多種炎癥介質(zhì)如一氧化氮（NO）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的miRNA-155敲除模型，幫助探究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中可抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子

據(jù)報(bào)道，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)影響著全世界2100多萬(wàn)人。RA是一種影響關(guān)節(jié)的自身免疫性炎癥疾病。它的特征是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜成纖維細(xì)胞增殖，最終的關(guān)節(jié)破壞。巨噬細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。RA炎性滑膜中巨噬細(xì)胞數(shù)量高于正常關(guān)節(jié)，與關(guān)節(jié)疼痛和炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。許多藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，基因或細(xì)胞療法。

MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16號(hào)染色體和人類21號(hào)染色體的BIC基因中被發(fā)現(xiàn)。在臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，miR-155與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，因?yàn)樗赗A患者的滑膜和滑膜液巨噬細(xì)胞中上調(diào)。siRNA敲低miR-155 (KD)可以抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。miR-155參與RA形成的機(jī)制可能是多方面的，其中之一是miR-155靶向Src同源性-2的3個(gè)未翻譯區(qū)域，其中包含肌醇磷脂酶1 (SHIP1)，炎癥的負(fù)調(diào)節(jié)因子。因此，RA中升高的miR-155導(dǎo)致SHIP1水平降低，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生升高。

研究者利用CRISPR/CAS9技術(shù)成功突變小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)源性miR-155基因，獲得miR-155基因組敲除(GKO)克隆。進(jìn)一步分析表明，在LPS刺激下，miR-155 GKO克隆表達(dá)更高水平的SHIP1，但產(chǎn)生較少的促炎細(xì)胞因子。

通過(guò)使用miR-155 GKO克隆，去除miR-155會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的減少，從而證實(shí)了之前的觀察，即升高的miR-155有助于RA患者細(xì)胞因子產(chǎn)生的持續(xù)水平。通過(guò)將miR-155模擬物轉(zhuǎn)染回GKO克隆，研究者能夠重新引入miR-155效應(yīng)。總之，這些結(jié)果表明，內(nèi)源性miR-155基因的突變可能導(dǎo)致pre-miR-155產(chǎn)物被截?cái)?，無(wú)法成熟為更短但穩(wěn)定的miR-155。

通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)將GFP敲入Raw264.7細(xì)胞，靶向NLRP3炎性小體，探究改善炎性疾病新靶點(diǎn)

NLR家族蛋白NLRP3是外源性病原體和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的胞質(zhì)傳感器。NLRP3激活后，與適配器蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1組裝，形成NLRP3炎性小體，導(dǎo)致caspase-1的裂解和激活?；罨腸apase-1裂解IL-1的細(xì)胞因子和IL-18的前體，使其成熟，并導(dǎo)致幾種促炎細(xì)胞因子的釋放，包括IL-1的細(xì)胞因子和IL-183。據(jù)報(bào)道，NLRP3炎癥小體在多種炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)已被證明在減輕敗血性休克、腹膜、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、T2D、多發(fā)性硬化、和痛風(fēng)等疾病中有效。因此NLRP3炎性小體是治療多種炎性疾病的一個(gè)極好的靶點(diǎn)。

利用CRISPR/Cas9在基因組水平上直接破壞關(guān)鍵分子-NLRP3，不僅可以完全抑制NLRP3炎癥小體的激活，還可以避免抑制抗炎生物制劑和抑制劑的脫靶途徑的潛在風(fēng)險(xiǎn)。研究CRISPR/Cas9敲除NLRP3的策略有望成為治療多種炎癥性疾病更有效的方法。

在這項(xiàng)研究中，研究者報(bào)道了一個(gè)系統(tǒng)的傳遞系統(tǒng)CRISPR/Cas9將mCas9和gNLRP3封裝進(jìn)CLAN中。CLAN是一種以PEG -b- PLGA為基礎(chǔ)的納米顆粒，輔以陽(yáng)離子脂質(zhì)BHEM - Chol，用于核酸治療的遞送。在之前的工作中，研究者們已經(jīng)將小干擾RNA、RNA適配體和乙肝病毒CpG導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞CLAN。

然而，mCas9/gNLRP3不同于其他核酸療法，納米顆粒的性質(zhì)影響給藥效率。為檢測(cè)CLAN42是否能有效遞送mCas9/ gRNA，研究者將Cas9和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)共表達(dá)mRNA (Cas9-EGFP mRNA，或mCas9-EGFP)及陰性對(duì)照gRNA (gNC)封裝到選擇的CLANs(CLANmCas9-EGFP/gNC)中。用不同的CLANmCas9- EGFP/gNC轉(zhuǎn)染骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDMs)。轉(zhuǎn)染組EGFP陽(yáng)性的BMDMs百分比最高。接下來(lái)，研究者通過(guò)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)GFP (Raw264.7-GFP)的Raw264.7細(xì)胞(巨噬細(xì)胞系)和包裹mCas9和gRNA靶向GFP (gGFP)的CLAN(CLANmCas9/gGFP)檢測(cè)基因敲除效率。轉(zhuǎn)染組中g(shù)fp敲除(KO) Raw264.7-GFP細(xì)胞比例最高，達(dá)53.9%。研究者通過(guò)向小鼠注射不同的CLANmCas9- EGFP /gNC進(jìn)一步證實(shí)了CLAN42的體內(nèi)mCas9/gRNA傳遞效率。注射組EGFPpositive腹膜巨噬細(xì)胞的百分比最高(48.4%)。綜上所述，由于其巨噬細(xì)胞攝取能力最強(qiáng)，所以在mCas9/gRNA傳遞中，CLAN42是最有效的，并且CLAN42更適合包封mCas9/gNLRP3(記為CLANmCas9/gNLRP3)用于多種炎癥性疾病的治療。

因此，研究者通過(guò)調(diào)整聚合物中陽(yáng)離子脂質(zhì)BHEM-Chol的重量和PEG5K-b-PLGA11K的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，建立了不同表面電荷和PEG密度的基團(tuán)庫(kù)。研究者在體外和體內(nèi)都篩選了家族，并選擇了一個(gè)更好的家族來(lái)將mCas9/gNLRP3導(dǎo)入巨噬細(xì)胞中，通過(guò)破壞巨噬細(xì)胞中的NLRP3來(lái)改善膿毒癥休克，mCas9/gNLRP3誘導(dǎo)的腹膜炎和HFDinduced T2D。研究為CRISPR/Cas9進(jìn)入巨噬細(xì)胞和治療多種炎癥性疾病提供了一個(gè)有前景的策略。

研究結(jié)果證明了CLANmCas9/ gNLRP3是一種很有前途的治療NLRP3依賴性炎癥性疾病的方法。研究也為通過(guò)納米顆粒介導(dǎo)的免疫細(xì)胞基因編輯治療免疫相關(guān)疾病提供了一個(gè)范例。

CRISPR-U?是源井生物自主研發(fā)的基因編輯技術(shù)（基于CRISPR / Cas9技術(shù)），CRISPR-U?技術(shù)比普通CRISPR/Cas9技術(shù)的基因切割效率更高，同時(shí)可以大幅度提升同源重組效率，輕松實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和動(dòng)物水平的基因敲除（KO）、基因點(diǎn)突變（PM）和基因敲入（KI）。利用CRISPR-U?的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，源井生物已成功在超過(guò)100種細(xì)胞系上實(shí)現(xiàn)基因編輯。

參考文獻(xiàn)

Jing W, Zhang X, Sun W, Hou X, Yao Z, Zhu Y. CRISPR/CAS9-Mediated Genome Editing of miRNA-155 Inhibits Proinflammatory Cytokine Production by RAW264.7 Cells.?Biomed Res Int. 2015;2015:326042. doi:10.1155/2015/326042

Xu C, Lu Z, Luo Y, et al. Targeting of NLRP3 inflammasome with gene editing for the amelioration of inflammatory diseases.[J]. Nature Communications, 2018, 9(1).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6484317/

作者 | Dr. ASAD UZZAMAN

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