基因研究揭示眼斑水龜屬（Sacalia）潛在遺傳多樣性
由于棲息地破壞與過度偷獵，我國本土龜鱉類普遍處于嚴重的生存危機之下。同時，由于物種分類混沌造成的基因污染，又使得本就任重道遠的保育工作雪上加霜。2022年末，由北京大學、海南師范大學主導的科研團隊對眼斑水龜屬物種進行了迄今最詳細的系統(tǒng)發(fā)育研究。此前，該屬長期被認為僅有眼斑水龜和四眼斑水龜兩種，且在廣東具有分布重疊區(qū)。該研究表明，沒有證據(jù)顯示這兩個物種目前有同地分布，但在珠江流域存在歷史自然雜交留下的穩(wěn)定雜種種群。該研究也證實了四眼斑水龜是一個復合種，其中海南的種群應提升為種，而廣西、越南等地更豐富的遺傳多樣性仍有待厘清。這些系統(tǒng)發(fā)育方面的努力，將有利于保護這群美麗但脆弱的山澗精靈。
文：Eikawa hinmaji、Infinity
眼斑水龜屬 (Sacalia) 分布于中國南部及印支半島東北部，其下有兩個物種：東部的眼斑水龜(S. bealei)與西部的四眼斑水龜(S. quadriocellata)。兩種在廣東有一分布重疊區(qū)域。它們頭后部的眼狀斑點、頸部明亮的豎條紋以及背甲的放射狀條紋使它們在一眾亞洲龜類中脫穎而出，極受龜類愛好者追捧，也因此飽受非法寵物貿(mào)易的荼毒；東亞、東南亞各國的食補傳統(tǒng)和民眾對“野味”的貪婪追求，更是讓所有本土龜類蒙受滅頂之災。2016年，眼斑水龜屬物種的市價猛漲至1000美元/公斤。近年來，該屬在野外已經(jīng)極為罕見，并于2021年被列為國家重點保護野生動物名錄的二級保護物種，但仍允許商業(yè)化養(yǎng)殖。同時，四眼斑水龜被IUCN紅色名錄列為極危物種，眼斑水龜被列為瀕危物種。
在中國，為滿足寵物市場和食用需求，龜鱉類的商業(yè)化養(yǎng)殖日益繁榮。不同地域種群乃至不同物種的人工雜交在養(yǎng)殖場中非常普遍，很可能威脅到自然種群的遺傳完整性。另一方面，對亞洲龜鱉目的生活史、系統(tǒng)發(fā)育和形態(tài)特征了解的嚴重缺乏，可能導致對亞洲隱存龜類多樣性的低估?(Gong et al.， 2018)。華鱉屬 (Pelodiscus)就是一個很好的例子。?近年來，斑點鱉(P. variegatus),?黃山鱉(P. huangshanensis),?和石片鱉 (P. shipian)等新種接連被發(fā)現(xiàn)，而這些分布狹窄、種群脆弱的物種長期被視作中華鱉 (P.sinensis)，被認為分布廣泛、野外種群不受威脅而不加節(jié)制地利用。
因此，為進一步研究與保護岌岌可危的眼斑水龜屬，厘清其內(nèi)部系統(tǒng)發(fā)育關系及不同地理種群的形態(tài)差異與分布范圍成為一亟待解決的問題。
先前的研究已經(jīng)揭示眼斑水龜屬內(nèi)部多樣性的豐富程度遠超我們的想象。2008年，基于已知采集地點的個體與市場樣本的CytB（線粒體細胞色素b基因）序列的眼斑水龜屬系統(tǒng)發(fā)生學研究揭示了S. bealei?和?S. quadriocellata?之間的高度分歧，并確定 S. quadriocellata 包含內(nèi)部三個亞演化支(東部、西北、西南) (Shi, Fong, et al., 2008; Shi, Parham, et al., 2008)。近期又有兩項工作，對這三個演化支做了進一步拆分。首先，針對四眼斑水龜西部種群（即前文的西北、西南演化支）的一項系統(tǒng)發(fā)生學研究引入了更多已知采集地點的樣本，進一步在越南和老撾確定了五個亞演化支 (Le et al.， 2020)。其次，先前被包含在東支中的海南島的四眼斑水龜種群與大陸種群相比，表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異 (Sun, 2015)和線粒體基因組分化(Lin et al.，2020)，因此被識別為一個獨立的物種，命名為海南四眼斑水龜Sacalia insulensis?(Lin et al.，2018,2020)。
然而，由于在這些研究中，來自中國大陸的已知產(chǎn)地的眼斑水龜屬物種樣本的代表性不足，因此難以獲取該屬的系統(tǒng)發(fā)育多樣性的全貌。除了線粒體系統(tǒng)發(fā)生學研究之外，基于核基因的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和形態(tài)學研究將更好地了解它們的進化、分類和保護。
基于采集自寵物貿(mào)易市場的標本，眼斑水龜屬的第三個物種擬眼斑水龜 (S.?pseuddocellata)?曾被描述，但隨后被視為四眼斑水龜和三線閉殼龜 (Cuora trifasciata)?之間的F1雜交個體而廢除(Shi, Fong, et al., 2008; Shi, Parham, et al., 2008; Stuart & Parham, 2007)。
然而，研究者近期在兩種眼斑水龜?shù)姆植贾丿B區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一形態(tài)特殊、兼具兩種眼斑水龜特征的種群——這類眼斑水龜在中國的寵物市場長期被視作兩種眼斑水龜?shù)碾s交。典型的四眼斑水龜頭部沒有或只有個別點紋，在干凈的背景色下，兩對相分離的眼斑顯得格外醒目。典型的眼斑水龜?shù)念^上有密集的黑點，兩對眼斑相連且前對輪廓模糊。這些新發(fā)現(xiàn)的“雜交龜”乍一看更接近四眼斑水龜，但它們有像眼斑水龜那樣，更暗的、幾乎相連的眼斑。與之前錯誤發(fā)表的人工雜交的產(chǎn)物“擬眼斑水龜”不同，這類眼斑水龜可能代表了一個未被正式描述的、自然發(fā)生的雜交種群。
本研究首次利用全范圍的樣本數(shù)據(jù)集，同時應用線粒體和核DNA標記來揭示整個眼斑水龜屬的系統(tǒng)地理格局和種群結(jié)構(gòu)，并利用遺傳分析和雜交模擬進一步探究了潛在的雜交種的起源。在此基礎上，作者為龜類的分類和保護提供了一些建議。
紅色為眼斑水龜，剩下的曾經(jīng)都被歸為“四眼斑水龜”。其中，已有研究提議海南的藍色種群應提升為種。以往的研究中，兩種眼斑水龜位于廣東的“同域分布區(qū)”被廣泛援引。然而，根據(jù)本文作者的長期調(diào)查和大范圍采樣，發(fā)現(xiàn)這兩個物種如今的分布范圍被珠江流域隔開（上圖綠色與紅色），并無重疊；但存在歷史遺留的自然雜交種群（黃色）。珠江水系可能是本屬擴散的天然障礙，因為它們更偏好山間小溪流，而非大河 (Gong et al.，2006; Hu et al.，2016)。
縮寫: SBE, 眼斑水龜S. bealei; SHY, 雜交眼斑水龜S. quadriocellata × bealei; SQUen, 四眼斑水龜東北種群northern east S.quadriocellata; SQUwn, 四眼斑水龜西北種群northern west S. quadriocellata; SQUes, 四眼斑水龜東南或海南種群southern east S. quadriocellata or Hainan S. quadriocellata; SQUwc, 四眼斑水龜中西部種群central west S. quadriocellata; SQUws, 四眼斑水龜西南種群southern west S. quadriocellata。
結(jié)果
1. 系統(tǒng)發(fā)育
研究人員首先對樣本的線粒體CytB基因進行了PCR擴增與測序，獲得約1140bp讀長的一致序列，據(jù)此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將樣本劃分為7個支系。
基于線粒體Cyt b基因構(gòu)建的進化樹揭示，東部四眼斑水龜由兩個亞演化支構(gòu)成，分別為包括所有采集于中國兩廣樣本的東北亞支(SQUen)和僅分布于海南島的東南亞支(SQUes)。西部四眼斑水龜分布于越南以及毗鄰地區(qū)，可以進一步細分為北(SQUwn)、中(SQUwc)、南(SQUws)三個亞支。北支分布于越南北部和鄰近的廣西（存疑），中支分布于越南中北部與老撾中部，南支分布于越南中部與中南部。所有分布在兩廣SQUen與SBE過渡分布區(qū)的疑似雜交種均包含在北支中，共享3個密切相關的mtDNA單倍型。
研究人員又挑選了16個核基因（長度總計約8.7kb）進行測序，用來檢驗線粒體基因進化樹的正確性，同時探究眼斑水龜?shù)姆N群遺傳結(jié)構(gòu)。
他們聚焦于上述7個支系中的眼斑水龜，四眼斑水龜“珠江”（SQUen）、“海南”（SQUes）、“北越”（SQUwn）種群，雜交種群這5個支系，共87個個體。確定每一個體在16個核基因位點的基因型后，用STRUCTURE軟件進行分類，若設置分為3類，可見眼斑水龜、雜交種群與各地的“四眼斑水龜”可以被清晰地區(qū)分開來，支持這三類相互之間具有一定遺傳獨立性；若提高分辨率，設置分為5類，則個體的分類結(jié)果與線粒體基因構(gòu)樹的結(jié)果大致吻合——這說明系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果是得到核基因與線粒體基因雙方支持的。
但是，有些個體存在線粒體與核基因來源不一致的情況，說明種群之間，如越南北部種群與廣西種群間，可能存在基因漸滲。
左圖體現(xiàn)了不同分辨率（K值）下，根據(jù)核基因的分類結(jié)果。PCA（右圖）中部不同顏色互相混合的數(shù)據(jù)點，反映了聚類與線粒體分類結(jié)果不一致的個體，暗示基因漸滲的存在。
2. 種群遺傳結(jié)構(gòu)
用75個典型個體代表上述5個種群，研究人員發(fā)現(xiàn)，同一種群內(nèi)部，多數(shù)基因都處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)。而“雜交種群”的雜交身份，也被坐實——它們確實為眼斑水龜和四眼斑水龜珠江種群的后代。
“雜交種群”有沒有可能并非雜交后代，而是單純地理隔離的產(chǎn)物？如果答案是肯定的，那么“雜交種群”的個體與某一親本種群個體的遺傳距離應隨著地理距離的增加而顯著增加。
結(jié)果顯示，在3個種群內(nèi)部（紅、黃、綠線），遺傳距離隨著地理距離的增加而增加；但種群間，遺傳距離與地理距離沒有關系。因此，作者認為，雜交種群（綠色）并不是某個種群地理隔離形成的產(chǎn)物。
我們知道，在雜交事件發(fā)生后，雜交種群中一個基因位點會存在兩種等位基因，分別來源于兩個祖先種群。當雜交種群再次與母本種群隔離后，這兩個等位基因要么因自然選擇，要么因遺傳漂變，只剩下一個留存在種群中，這就是等位基因的固定（fixation）。
本文在16個基因中鑒定了8個在眼斑水龜、四眼斑水龜珠江種群中差異較大的基因。比較發(fā)現(xiàn)，在雜交種群中，這8個基因大多數(shù)已經(jīng)固定，僅存某一親本特有的等位基因。根據(jù)粗略的計算，假設種群中每代有100個個體，則基因經(jīng)過隨機的遺傳漂變達到這種程度的固定需要100代以上的時間（大約500年）?？紤]到真實情況比計算模擬復雜很多，比如歷史上有效種群遠大于100及親本持續(xù)的基因漸滲，該自然雜交種群的隔離時間可能遠比模擬結(jié)果更長。
有趣的是，該雜交種群的線粒體基因完全是四眼斑水龜珠江種群的類型——可能線粒體經(jīng)過遺傳漂變，或雜交具有固定的性別偏向，如雄性眼斑水龜傾向于和雌性四眼斑水龜交配，反之則不行。這個問題，或許需要更多的生態(tài)學與行為學數(shù)據(jù)才能解答。
3.?形態(tài)學區(qū)分
結(jié)論
本研究對眼斑水龜屬種群的遺傳多樣性、地理分布和基因流進行了全面的分析。在該屬中發(fā)現(xiàn)了6個線粒體亞支，表明其多樣性高于預期。系統(tǒng)發(fā)育分析表明海南四眼斑水龜(SQUes)構(gòu)成一個獨特的支系且為遺傳地位最為孤立的種群，這與之前的研究一致(Lin et al.，2020)。形態(tài)學方面的研究同樣表明，海南和中國大陸的個體在體型大小、頭部和殼的形狀以及腹甲斑塊形狀與面積等方面均存在顯著差異。此外，海南四眼斑水龜在地理上與其他種群隔離，符合生殖隔離和生態(tài)位分化的條件。因此，有充分證據(jù)支持將海南四眼斑水龜提升至種的地位（也就是?S.?insulensis?）。然而這一提升將使剩下的四個亞演化支成為并系群。接下來，應收集更充分的基因和形態(tài)學證據(jù)，將每個亞支提升為種。但目前，采樣密度的局限性阻礙了對四眼斑水龜復合種更為全面的拆分。SHY符合雜交分類單元的定義，即“一個獨立進化的、歷史穩(wěn)定的種群或一組種群，具有來自兩個或多個離散親本分類單元的遺傳特征的獨特組合”(Allendorf et al.，2001)。因此，應將其作為一個獨立的自然雜交種單獨對待，即?S. quadriocellata?x?bealei。這也是中國首個被報道的龜類自然雜交種群。綜上所述，眼斑水龜屬應被視作是七個不同的進化顯著單元，在人工圈養(yǎng)繁殖中應該避免雜交。本研究的精細采樣顯示了中國南方眼斑水龜豐富的遺傳多樣性，揭示了亞洲淡水龜類巨大的隱存多樣性，強調(diào)了該地區(qū)進一步開展兩棲爬行動物學研究和保護的緊迫性。
原文
Lin, L., Chen, H., Gaillard, D., Shi, H. and Luo, S. (2022). Phylogeography of the endangered ‘eyed’ turtles (genus?Sacalia) and the discovery of a lineage derived from natural interspecific hybridization.?Ecology and Evolution, 12(12). doi:10.1002/ece3.9545.
