基因克隆是分子生物學(xué)中的一種基本的操作方法。即載體構(gòu)建，構(gòu)建的實驗通俗點來說就是”切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”，切目的片段和載體，將正確的片段和載體連接，做轉(zhuǎn)化，擴(kuò)大培養(yǎng)增加構(gòu)建好的載體數(shù)，送測序進(jìn)行檢測；在具體的實驗中因為構(gòu)建的方法不一樣會有很多的細(xì)節(jié)發(fā)生變化，現(xiàn)下用的較多的就是雙酶切和同源重組的方法。通過雙酶切來構(gòu)建載體是其中常用的一種方法，這種方法利用限制性內(nèi)切酶可以識別并切割特定的核苷酸的原理，用兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割靶基因得到前后都帶有粘性末端的靶基因片段，與同樣經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶切割得到的帶有相同粘性末端的線性載體在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，從而實現(xiàn)基因克隆。

一、目的基因的擴(kuò)增

首先用軟件設(shè)計目的基因的引物，引物中需要加入酶切位點及保護(hù)性堿基，在NCBI上BLAST保證引物的特異性，以及需要注意引物的Tm值、GC含量等等；然后從樣本中擴(kuò)增出我們需要的目的基因的條帶，需要用到PCR酶，樣本來源可以是基因組DNA也可以是CDNA等，根據(jù)構(gòu)建的載體的不同選擇，例如干擾載體、過表達(dá)載體、基因編輯載體，啟動子分析載體等等；后面將PCR產(chǎn)物跑膠，看產(chǎn)物是否是特異的條帶，只需將正確的條帶切膠進(jìn)行膠回收即可，或者取5ul的產(chǎn)物跑膠確認(rèn)特異性條帶后直接將剩下的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收就可以得到目的基因的條帶了。

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二、目的基因和質(zhì)粒載體的酶切和回收

限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，所選擇的的雙切酶最好是公用的buffer，一致的反應(yīng)的條件。兩種酶切的條件不同時，分別進(jìn)行兩次酶切，切完一個純化后再切：溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的。包括酶的用量，以及產(chǎn)物或者質(zhì)粒與酶之間的量的把握也是至關(guān)重要的，即避免酶切不完全的情況，也在規(guī)定的時間內(nèi)達(dá)到最好的酶切效果?；厥湛梢圆捎媚z電泳跑電泳切膠來進(jìn)行，也可以采用簡單的柱式產(chǎn)物回收的方法，由于切割后不需要的片段很短，所以在柱式純化中可以過濾掉，避免了切膠回收的復(fù)雜的操作。

三、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶首先是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，幾乎所有的細(xì)菌的屬、種都發(fā)現(xiàn)了這種酶。它是可以識別并附著特定的核苷酸序列，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。每個限制性內(nèi)切酶會識別特定的DNA序列，根據(jù)不同的限制酶類型，可在識別序列內(nèi)或距識別序列不遠(yuǎn)處的位置切割DNA，識別序列通常是4-8bp，酶切之后會形成粘性末端（5ˊ端或3ˊ端突出）或者平末端。（圖1）

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根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性內(nèi)切酶同時具有修飾及認(rèn)知切割的作用。其中Type II型限制性內(nèi)切酶只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進(jìn)行。所識別的位置多為短的回文序列（palindrome sequence），所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列；是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類，例如：EcoRI、HindⅢ、BamH I、ApaLI、。有些酶的切割位點在回文的一側(cè)（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在回文序列中間，形成平整末端。

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四、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒的連接

用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，不同廠家的連接酶按照說明書操作即可，如果擔(dān)心質(zhì)粒存在酶切不完全的情況在后續(xù)的轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可以將酶切后的產(chǎn)物不連接作為對照試驗。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上，時間3個小時足已。

五、構(gòu)建好的質(zhì)粒做轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的載體加入至感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘，42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘，

加入陰性培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘，取其中一些鋪板，過夜培養(yǎng)挑取單克隆進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒即可。

六、其他克隆的試劑盒

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