近日，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胡治平教授和湖南師范大學(xué)盧明教授、陳平教授共為通訊作者，在 Journal of Nanobiotechnology (IF: 10.435) 發(fā)表了題為“Extracellular vesicles derived from hypoxia-preconditioned olfactory mucosa mesenchymal stem cells enhance angiogenesis via miR-612”的研究論文，報(bào)道了嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源的胞外囊泡在缺氧條件下調(diào)控血管生成的分子機(jī)制。

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院葛麗特博士后為第一作者。歐易生物在本研究中承擔(dān)了?small RNA 測(cè)序及分析工作。

?研究背景?

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）在組織修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，缺氧預(yù)處理的 MSCs 能顯著提高體外細(xì)胞存活、增殖和血管生成相關(guān)的生長因子。

嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞 (OM-MSCs) 是一種位于嗅覺固有層的新型常駐干細(xì)胞，具有高增殖率、自我更新和多能分化的能力。OM-MSCs 在缺血性腦卒中治療中可以發(fā)揮積極的作用。但將干細(xì)胞直接應(yīng)用于治療仍存在可能形成腫瘤、血栓等諸多風(fēng)險(xiǎn)。

胞外囊泡是細(xì)胞主動(dòng)分泌到胞外的有膜小泡（EV），可以攜帶 miRNA、mRNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，傳遞給受體細(xì)胞，起到細(xì)胞間通訊的作用。本研究重點(diǎn)關(guān)注 OM-MSC-EV 對(duì)血管生成的影響及其機(jī)制。

?研究內(nèi)容?

本研究從常氧和缺氧 OM-MSC 細(xì)胞上清中分離的細(xì)胞外囊泡 H-EV 和 N-EV，經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，兩種 OM-MSC-EV 都能促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HBMECs) 的增殖、遷移和血管生成活性。且與常氧組相比，低氧預(yù)處理后 OM-MSC-EVs 的血管生成刺激活性顯著增強(qiáng)。從機(jī)制上講，H-EV 攜帶 miR-612 至靶細(xì)胞，結(jié)合在靶細(xì)胞內(nèi)?TP53?mRNA 的 3’-UTR 區(qū)域抑制其表達(dá)，進(jìn)而通過促進(jìn) HIF-1α和 VEGF 表達(dá)，以調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)表明，低氧預(yù)處理的 OM-MSCs-EVs 可促進(jìn)血管生成，為治療如腦梗死等缺血性疾病提供新的治療策略。

?研究結(jié)果?

1.?缺氧預(yù)處理的 OM-MSC-EV 增強(qiáng)了血管生成活性

從培養(yǎng)的常氧和缺氧 OM-MSC 細(xì)胞上清中分別分離了細(xì)胞外囊泡 H-EV 和 N-EV，并通過 WB、透射電子顯微鏡和 NTA 進(jìn)行了鑒定。接下來研究 EV 對(duì)血管細(xì)胞內(nèi)皮生成的影響，結(jié)果顯示，N-EV 和 H-EV 都可以促進(jìn) HBMEC 細(xì)胞的增殖。并且對(duì)比 N-EV，H-EV 對(duì)血管生成的促進(jìn)更為明顯。

?圖 1 | H-EV 在體外增強(qiáng)了 HBMEC 血管生成活性

2.?H-EV 運(yùn)輸 miR-612 到靶細(xì)胞中

miRNA 芯片檢測(cè)顯示，N-EV 和 H-EV 之間有 19 個(gè) miRNA 存在表達(dá)差異，其中 miR-612 在 H-EV 中表達(dá)上調(diào)（圖 A-B）。并且預(yù)測(cè)表明 miR-612 的靶基因主要參與 HIF-1α 和 VEGF 信號(hào)通路（圖 C）。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)顯示，低氧條件下 OM-MSC 細(xì)胞中 miR-612 比常氧條件下 OM-MSC 表達(dá)高，并且對(duì)應(yīng)的 EV 中 miR-612 含量也高（圖 D-E）。

對(duì)經(jīng) N-EV 和 H-EV 處理的 HBMEC 細(xì)胞進(jìn)行 RT-PCR，結(jié)果顯示 H-EV 處理后 miR-612 含量顯著升高（圖 F），表明 miR-612 可能通過 EV 運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中。

為進(jìn)一步證明 EV 中 miR-612 的作用，利用 OM-MSC-EVanti-miR-612（敲低了 miR-612 的 OM-MSC 產(chǎn)生的 EV）處理 HBMEC 細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，OM-MSC-EVanti-miR-612?處理的 HBMEC 細(xì)胞增、遷移和血管生成顯著降低（圖 G-J）。

在 HBMEC 細(xì)胞中直接進(jìn)行 miR-612 敲降和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，同樣表明 miR-612 可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性。

圖 2 | miR-612介導(dǎo) OM-MSC-EV 對(duì) HBMEC 的促血管生成作用

3.?OM-MSC-EV 轉(zhuǎn)運(yùn)的 miR-612 通過 TP53 調(diào)節(jié) HBMEC 的血管生成

有研究表明，抑制 TP53 可上調(diào) HIF-1α 和 VEGF 的表達(dá)。有趣的是，H-EV 和N-EV 處理 HBMEC 后，TP53 mRNA 和蛋白水平降低，且缺氧組 TP53 的降幅大于常氧組（圖 A-C）。預(yù)測(cè)分析顯示?TP53?是 miR-612 的靶基因（圖 D）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-612 可以特異性結(jié)合到?TP53?mRNA 的 3’-UTR（圖 D）。

qRT-PCR 和 WB 實(shí)驗(yàn)顯示，TP53?mRNA 和蛋白質(zhì)水平在過表達(dá)了 miR-612 的 HBMEC 中顯著下降，HIF-1α 和 VEGF mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨之上升（圖 E-F）。反之?TP53?mRNA 和蛋白質(zhì)水平在敲降了 miR-612 的 HBMEC 中顯著上升，HIF-1α 和 VEGF mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨之下降（圖 E, G）。

同時(shí)，在 HBMEC 細(xì)胞中直接進(jìn)行?TP53?敲降和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，同樣表明抑制?TP53?可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性。以上結(jié)果表明，靶向調(diào)控?TP53?表達(dá)是 miR-612 促進(jìn)血管生成的部分原因。

圖 3 | OM-MSC-EV 轉(zhuǎn)運(yùn)的 miR-612 通過 TP53 調(diào)節(jié) HBMEC 的血管生成

4.?H-EV 富集 miR-612 并在體內(nèi)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成

接下來在裸鼠中研究 H-EV 在體內(nèi)的作用。結(jié)果顯示，H-EV 和 N-EV 都可以在體內(nèi)誘導(dǎo)新血管形成，并且低氧 OM-MSC-EV 比常氧 OM-MSC-EV 誘導(dǎo)更大的血管形成。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：TP53?蛋白水平降低，并且 N-EV 處理中下降更為明顯；HIF-1α 和 VEGF 表達(dá)水平升高，并且低氧組高于常氧組。

同時(shí)，將敲降/過表達(dá) miR-612 的 OM-MSC-EV 注射到裸鼠體內(nèi)，與體外實(shí)驗(yàn)一致：過表達(dá) miR-612 可以促進(jìn)血管生成，同時(shí)對(duì)應(yīng)的?TP53?表達(dá)下降，HIF-1α 和 VEGF 表達(dá)上升；反之，敲降 mR-612 可以抑制血管生成。

綜上表明，H-EV 富集的 miR-612 可以在體內(nèi)通過?TP53?信號(hào)通路以調(diào)控血管生成。

圖 4 | H-EVs 促進(jìn)體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成

?研究結(jié)論?

本研究表明 H-EV 顯著促進(jìn)血管生成。miR-612 可能在H-EV 依賴的血管生成調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。EV 是 OM-MSC 功能的重要介質(zhì)，有望作為一種新納米給藥系統(tǒng)用于缺血性疾病治療。因此，MSC-EV 的缺氧預(yù)處理為臨床使用干細(xì)胞來源的產(chǎn)品治療缺血性疾病提供了一種新策略。

?原文鏈接?

https://doi.org/10.1186/s12951-021-01126-6

END

鄭小辮兒? ?撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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