2022年2月22日，廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所齊永文教授團(tuán)隊在The Crop Journal（IF 4.407）發(fā)表關(guān)于單細(xì)胞圖譜解析玉米根尖的相關(guān)報道，該篇文章中，李旭輝老師為該篇文章的第一作者，歐易生物提供了該篇文章的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序工作。下面我們一起學(xué)習(xí)這篇文章的具體內(nèi)容。

材料：玉米自交系B73幼苗根尖

期刊：The Crop Journal

發(fā)表時間：2022年2月

方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

研究背景和研究目的

根系是玉米生長和產(chǎn)量的基礎(chǔ)。初生根由維管柱和皮層兩部分組成，維管柱又由負(fù)責(zé)運輸水和營養(yǎng)的木質(zhì)部導(dǎo)管以及負(fù)責(zé)運輸光合產(chǎn)物和其他有機(jī)物的初生韌皮部組成，幫助植物吸收養(yǎng)分。

除了玉米自身根系的解剖特點，玉米產(chǎn)量的增加在很大程度上與氮肥的使用有關(guān)。然而，作物根系吸收氮的效率相對較低，這提示我們調(diào)控根系發(fā)育是提高產(chǎn)量和肥料利用效率的有效策略。

因此，該篇文章旨在通過單細(xì)胞測序解析玉米根尖細(xì)胞組成圖譜以及響應(yīng)硝酸鹽信號的特異性細(xì)胞類型，有助于研究人員精細(xì)調(diào)控根系結(jié)構(gòu)和限制條件下的營養(yǎng)物質(zhì)吸收。

研究內(nèi)容

作者對生長在含硝酸鹽（硝酸鹽+）和不含硝酸鹽（硝酸鹽-）培養(yǎng)基上的玉米幼苗根尖進(jìn)行了單細(xì)胞測序，測序結(jié)果鑒定出大部分細(xì)胞類型。為了表征單細(xì)胞水平上玉米根對硝酸鹽的反應(yīng)，作者按照分組硝酸鹽+和硝酸鹽-，比較了每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)85種細(xì)胞類型特異性的硝酸鹽響應(yīng)基因。

作者還針對皮層、維管柱、根毛以及表皮細(xì)胞進(jìn)行擬時序分析，探討細(xì)胞發(fā)育軌跡中相關(guān)基因的表達(dá)模式的改變。此外，通過對玉米和水稻單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的種間比較，揭示了玉米和水稻根系細(xì)胞類型多樣性和保守性。

玉米根尖單細(xì)胞測序及細(xì)胞類型鑒定

作者針對玉米幼苗主根的20個根尖 (底部2cm) 進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序 (圖1A），硝酸鹽+組和硝酸鹽-組各自得到3790和3426個根部細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。為了評估scRNA-seq的穩(wěn)健性和使用原生質(zhì)體進(jìn)行測序的效果，作者同時對根尖進(jìn)行了bulk RNA-seq，并對scRNA-seq和bulk RNA-seq結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩個測序結(jié)果之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性 (硝酸鹽+組和硝酸鹽-組的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.8529和0.8500) （圖1B, C）。作者接下來整合兩個scRNA-seq表達(dá)矩陣，進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定以及進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析（圖1D, 圖 2）。

數(shù)據(jù)整合后分為11個cluster，作者使用了三種策略對細(xì)胞類型進(jìn)行注釋：

（1) 參考文獻(xiàn)中報道已知的標(biāo)記基因，例如cluster 10，特異性表達(dá)根冠marker ZmRCP1, ZmRCP2, ZmGRP4, ZmGRP6, Zm109和phyA2（圖1F）；

（2) 計算單細(xì)胞數(shù)據(jù)中每個cluster與手工或激光捕獲顯微解剖分離的根細(xì)胞的bulk RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，cluster 8和10利用此種方法注釋為維管束鞘和根毛細(xì)胞（圖1G）；

（3) 對已知標(biāo)記基因較少和組織特異性RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)較少的cluster進(jìn)行FISH檢測，選擇Seurat FindMarkers功能鑒定出的9個cluster特異性基因用于FISH，其中，Zm00001d049916在維管柱中顯著表達(dá)，Zm00001d041611在表皮中顯著表達(dá)。

綜上所述，共鑒定出11種細(xì)胞數(shù)量差異較大的主要細(xì)胞類型或組織，代表了玉米根尖的主要細(xì)胞類型，反映了玉米根尖的高度異質(zhì)性。

圖1 | 玉米根尖細(xì)胞的單細(xì)胞測序和細(xì)胞類型鑒定

圖2 | 玉米根尖各細(xì)胞標(biāo)記基因的根尖結(jié)構(gòu)和GO功能示意圖

篩選特定細(xì)胞類型中響應(yīng)硝酸鹽反應(yīng)的基因

為了在單細(xì)胞水平上表征玉米根系對硝酸鹽的響應(yīng)，研究人員對生長在硝酸鹽+組和硝酸鹽-組的培養(yǎng)液中的玉米根系單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。分析結(jié)果顯示，在兩組分組中，根尖細(xì)胞類型數(shù)量和比例組成相似，除根冠細(xì)胞外，其余細(xì)胞類型在兩組中的相關(guān)性較高（圖3B）。為了確定細(xì)胞類型特異性基因?qū)ο跛猁}的響應(yīng)，每種細(xì)胞類型的細(xì)胞根據(jù)分組處理分成兩個假定的cluster，兩個cluster之間的DEGs認(rèn)為是細(xì)胞類型特異性的硝酸鹽反應(yīng)基因。共確定出85個DEGs，其中上調(diào)基因48個，下調(diào)基因37個 (圖3A-left）。與bulk RNA-seq相比，從scRNA-seq中得到的63個DEGs被bulk RNA-seq鑒定為硝酸鹽反應(yīng)基因。通過GO富集分析，在皮質(zhì)中鑒定出的39個DEGs與非生物刺激、激素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)（圖3A-right）；表皮特異性標(biāo)記基因與離子轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)。兩個硝酸代謝相關(guān)基因ZmNAR2.1 (硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白/ZM001D017095) 和ZMGS2 (谷氨酰胺合成酶2 / ZM001D026501) 在硝酸鹽+組根的表皮細(xì)胞中上調(diào)（圖3C–E）。在玉米根部的分生區(qū)（MZ）細(xì)胞中，硝酸鹽誘導(dǎo)了ZmNIR1 (亞硝酸鹽還原酶1 / zm001d018161) 基因的激活（圖3C, F）。

圖3 | 細(xì)胞類型特異性硝酸鹽反應(yīng)基因

主要根尖細(xì)胞類型的擬時序分析

根尖細(xì)胞類型在幼苗階段呈現(xiàn)動態(tài)發(fā)育過程，由一群未分化的頂端分生組織細(xì)胞逐漸分化形成。作者利用monocle3對細(xì)胞進(jìn)行擬時序分析（圖4A），得到始于分生區(qū) (MZ) 細(xì)胞的連續(xù)擬時序軌跡（圖4B）。擬時序時間沿兩條軌跡增加，皮層發(fā)育軌跡包括皮層和外皮層，而不包括內(nèi)皮層；維管柱發(fā)育軌跡主要包括維管柱、原生韌皮部、伴細(xì)胞 (CC) 和維管柱鞘。

接下來，作者進(jìn)一步針對擬時序軌跡中的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZM00001D026163 (編碼類伸展素蛋白/rgg144) 在皮質(zhì)細(xì)胞中隨著擬時序軌跡曲線的發(fā)展表達(dá)量逐漸上升（圖4C）。為了觀察表皮細(xì)胞 (根毛和表皮細(xì)胞) 的發(fā)育軌跡，作者采用slingshot算法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了起點相同的兩個分支（圖4D–F），這些細(xì)胞可以進(jìn)一步分為四個亞群 （圖4E）。擬時序軌跡起源于表皮細(xì)胞 (亞群1和2)，并逐漸以根毛細(xì)胞 (branch 1) 和成熟的表皮細(xì)胞 (branch 2) 兩種分化的細(xì)胞類型結(jié)束（圖4E）。將表皮和根毛的Marker基因映射到擬時序軌跡或者，結(jié)果顯示在每種細(xì)胞類型中都有特定的表達(dá)（圖4G–I）。為了進(jìn)一步描述整個軌跡的基因表達(dá)模式，作者將表皮和根毛軌跡中最重要的100個基因進(jìn)行聚類，并將其分為兩個主要的基因簇。這兩個分支的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯不同的基因表達(dá)模式（圖4J）。雖然gene cluster1的部分基因 (底部) 傾向于在branch2中高表達(dá)，但整體表達(dá)模式并未表現(xiàn)出分支特異性。gene cluster2包含44個基因，這些基因優(yōu)先表達(dá)在由根毛細(xì)胞組成的branch1中，并且這些基因在與生毛細(xì)胞分化和植物型細(xì)胞壁組織相關(guān)的GO中富集（圖4J-right）。這些發(fā)現(xiàn)證實了根毛細(xì)胞由表皮細(xì)胞分化而來，反映了根表皮細(xì)胞分化過程中的轉(zhuǎn)錄重組，重現(xiàn)了根毛的發(fā)育過程。

圖4 | 根尖細(xì)胞的擬時序和發(fā)育軌跡分析

玉米和水稻的根細(xì)胞類型和細(xì)胞類型特異性基因的保守性

為了研究玉米和水稻根系的異同，作者對玉米和水稻根系的scRNA-seq表達(dá)譜進(jìn)行了比較。首先，作者從9311、Nipponbare (Nip) 和ZH11這3個已發(fā)表的水稻根scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，根據(jù)MaizeGDB定義了一組玉米和水稻的一對一同源基因?qū)?，利?996對同源基因?qū)M(jìn)行整合分析。然后，作者整合了水稻和玉米的scRNA-seq數(shù)據(jù)，進(jìn)行降維聚類分析（圖5A）。在0.6的分辨率下共分出22個cluster （圖5B）。由于水稻的細(xì)胞類型已經(jīng)由數(shù)據(jù)來源作者注釋完成，因此作者直接將細(xì)胞類型映射到了cluster中（圖5D）。根據(jù)映射結(jié)果，根毛、內(nèi)皮層、韌皮部和外皮層具有較高的相似性。特別是玉米和水稻的根毛細(xì)胞表現(xiàn)出較高的相關(guān)性，聚成同一簇 (cluster 14)。利用根毛、內(nèi)皮層和韌皮部3種保守細(xì)胞類型，鑒定了玉米和水稻中保守細(xì)胞類型的表達(dá)基因。玉米和水稻的5個scRNA-seq數(shù)據(jù)集的根毛細(xì)胞具有高度的轉(zhuǎn)錄相似性。對于根毛細(xì)胞，基因聚類分析顯示，在兩種植物的根毛中共表達(dá)了58個保守基因，GO富集分析表明，這些玉米的同源基因參與了根毛和表皮細(xì)胞的發(fā)育（圖5C）。這些結(jié)果揭示了玉米和水稻同源保守基因在功能上的相似性，為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型或組織特異性基因提供了一種新的潛在方法。

圖5 | 玉米和水稻細(xì)胞類型的比較

研究結(jié)論

這篇文章鑒定了玉米根尖的主要細(xì)胞類型，以及一系列細(xì)胞類型特異性的硝酸鹽響應(yīng)基因，為研究細(xì)胞類型分化和對硝酸鹽刺激的響應(yīng)提供了有價值的資源。作者進(jìn)一步比較了玉米和水稻的scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了進(jìn)化保守的細(xì)胞類型和基因。文章中所表征的基因可作為基因轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步遺傳分析的靶點，幫助研究人員準(zhǔn)確控制特定細(xì)胞類型或組織中的基因表達(dá)和表型變異。

[1] LI X, ZHANG X, GAO S, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the landscape of maize root tips and assists in identification of cell type-specific nitrate-response genes [J]. The Crop Journal, 2022,?

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