? ?厚積薄發(fā)??

類(lèi)器官技術(shù)建立在干細(xì)胞技術(shù)以及經(jīng)典發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞混合實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上；類(lèi)器官的出現(xiàn)無(wú)疑是對(duì)干細(xì)胞研究不懈探索的驚喜回饋。

腸上皮是成年哺乳動(dòng)物中自我更新最快的組織，自 2007 年，Hans Clevers 實(shí)驗(yàn)室就通過(guò)譜系追蹤 (lineage tracing) 發(fā)現(xiàn)腸道 Wnt 靶基因中隱窩基底循環(huán)柱狀細(xì)胞表達(dá)的 Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Gpr49) 可作為腸和結(jié)腸的干細(xì)胞的成體干細(xì)胞標(biāo)志物，這也就是大名鼎鼎的 Lgr5+?細(xì)胞。

2009 年，Hans Clevers 和 Toshiro Sato 用來(lái)源于小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出一個(gè)微型腸道 (Mini-guts) 類(lèi)器官，開(kāi)啟了類(lèi)器官技術(shù)的發(fā)展的“新紀(jì)元”。

圖 1. 類(lèi)器官培養(yǎng)發(fā)展時(shí)間軸[2]

?腸道類(lèi)器官技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，包括疾病建模、藥物開(kāi)發(fā)和篩選、宿主-微生物相互作用、腸道生物學(xué)與發(fā)育等。
也有研究描述了將基因組編輯技術(shù)，如 CRISPR/Cas9 與類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合，使類(lèi)器官易于基因操縱，并將其轉(zhuǎn)化為一個(gè)多功能的培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，腸類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)啟了小腸上皮體外建模的新時(shí)代，在個(gè)性化和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。??

腸道類(lèi)器官的 “養(yǎng)成記”??

3D 腸類(lèi)器官由一個(gè)封閉的循環(huán)中空腔組成，內(nèi)襯一層腸上皮細(xì)胞系。腸上皮的分化細(xì)胞系，包括腸上皮細(xì)胞，腸內(nèi)分泌細(xì)胞和杯狀 (Paneth) 細(xì)胞，排列在絨毛狀區(qū)內(nèi)。?

腸類(lèi)器官的發(fā)育類(lèi)器官可來(lái)源于器官限制成體干細(xì)胞?(ASCs)?和多能干細(xì)胞?(PSCs)?兩種干細(xì)胞。這兩種干細(xì)胞來(lái)源產(chǎn)生的類(lèi)器官包含體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的所有腸上皮細(xì)胞類(lèi)型，比例和排列相似。

圖 2. 體外培養(yǎng) ASC 來(lái)源的腸類(lèi)器官[3]?

培養(yǎng)類(lèi)器官的主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)和培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加促腸道發(fā)育的生長(zhǎng)因子。其中，細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 為干細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和分化提供了必需的結(jié)構(gòu)支持和生化誘因。類(lèi)器官的形成和生長(zhǎng)在很大程度上依賴(lài)于培養(yǎng)基成分，這些成分構(gòu)成了十分接近體內(nèi)干細(xì)胞生態(tài)位 (Niche) 的信號(hào)通路，以維持干細(xì)胞的功能，促進(jìn)其擴(kuò)展和分化為器官的特定細(xì)胞類(lèi)型。?如果把腸道類(lèi)器官培養(yǎng)當(dāng)成是養(yǎng)成游戲，那么該怎么喂養(yǎng)呢，“定食” 還是“DIY 自助餐”？

圖 3. 體外培養(yǎng) PSC 來(lái)源的腸類(lèi)器官[3]

■ 基礎(chǔ)套餐來(lái)一套：

腸道類(lèi)器官培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分包括 Wnt-3a (W)、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) (E)、Noggin (N) 和 R-spondin-1 (R)，統(tǒng)稱(chēng)為 WENR 培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中有序地添加這些生長(zhǎng)因子可調(diào)控干細(xì)胞生態(tài)位信號(hào)通路 (包括 Wnt、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) 和 Notch 信號(hào)通路)，誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞 (ISCs) 自我更新、增殖和分化。

■ “自助”更有它的妙：

也有一些研究表明，向 ENR 培養(yǎng)基 (包含?EGF + Noggin + R-spondin-1) 中加入其它成分，以誘導(dǎo)干細(xì)胞走向特定的分化命運(yùn)。

例如，引入兩種小分子的組合，如 CHIR99021?+ Valproic acid?或者是?LDN-193189?+ CHIR99021，可協(xié)同促進(jìn) Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化狀態(tài)下的維持，得到富含 ISCs 的培養(yǎng)。

通過(guò)補(bǔ)充 DAPT?+ CHIR99021、Valproic acid +?IWP-2 或 DAPT + IWP-2 的 ENR 培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得分化表型，這些分子相互配合誘導(dǎo) ISCs 直接分化為 Paneth 細(xì)胞 (杯狀細(xì)胞) 及腸細(xì)胞和分泌細(xì)胞譜系 (腸內(nèi)分泌細(xì)胞)。也有人認(rèn)為，DAPT 或 BMP 分子的加入足以促進(jìn) ISC 分化并產(chǎn)生多譜系腸類(lèi)器官。

雖然關(guān)于類(lèi)器官培養(yǎng)基的組成有詳細(xì)的綜述，但不同方案的成分有時(shí)會(huì)存在差異，在培養(yǎng)技術(shù)中需要大量的試驗(yàn)和摸索，以確定劑量和時(shí)機(jī)，達(dá)到預(yù)期結(jié)果。

?有說(shuō)有練真把式?，培養(yǎng)基 DIY！??

2020 年 3 月，類(lèi)器官“鼻祖” Hans Clevers 的團(tuán)隊(duì)再在 Science 上發(fā)表大作：SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes，揭示了新型冠狀病毒對(duì)人類(lèi)腸道的有效感染。他們靈活運(yùn)用腸道類(lèi)器官的培養(yǎng)條件，將病毒對(duì)人類(lèi)腸道的感染可視化。

hSIO (human small intestinal organoids; 人類(lèi)小腸類(lèi)器官) 由原代腸道上皮干細(xì)胞建立，通過(guò)符合倫理規(guī)范途徑獲得人類(lèi)腸道組織樣本。他們?cè)O(shè)定了四種不同培養(yǎng)（EXP、DIF、DIF-BMP、EEC）條件：

EXP：在 Wnt EXP (Expansion medium)?中生長(zhǎng)的 hSIO 絕大多數(shù)由干細(xì)胞和腸細(xì)胞祖細(xì)胞組成，與 Wnt 條件培養(yǎng)基不同，培養(yǎng)基中添加 Wnt 替代物?(U-Protein Express)。

DIF：在 ENR 中實(shí)現(xiàn)了一般分化，稱(chēng)為 DIF (differentiation medium)，在 DIF 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的類(lèi)器官含有腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞?(EEC)。

DIF+BMP：通過(guò)從 ENR 中除去 Noggin 并添加 BMP-2/BMP-4 激活 BMP，導(dǎo)致進(jìn)一步成熟。

EEC: 在?DIF + BMP 的條件下，用強(qiáng)力霉素?(Doxycycline) 在 ENR 培養(yǎng)基中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體中誘導(dǎo) NeuroG3 的表達(dá)，以誘導(dǎo) EEC 數(shù)量增加。

如圖 3 所示，四種培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的?hSIO 暴露于?SARS-CoV??和?SARS-CoV-2 2 種病毒。在所有培養(yǎng)條件下，兩種病毒的傳染性病毒顆粒和病毒 RNA 的滴度均顯著增加。

?

圖 4：SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 在 hSIO 中復(fù)制[12]

SARS-CoV（藍(lán)）SARS-CoV-2（紅）感染后 24、48 和 60 小時(shí)，測(cè)定裂解的類(lèi)器官活病毒滴度。

為了確定病毒目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型，對(duì) hSIO 進(jìn)行了共聚焦分析，不同的培養(yǎng)條件下共聚焦分析顯示，SARS-CoV-2 的目標(biāo)細(xì)胞為增殖的腸上皮細(xì)胞祖細(xì)胞?(EXP 條件下) 或有絲分裂后的腸細(xì)胞 (DIF 條件下)，而腸內(nèi)分泌細(xì)胞幾乎沒(méi)有感染。

圖 5. SARS-CoV-2 感染?hSIO?的共聚焦分析[12]

類(lèi)器官腸上皮細(xì)胞刷狀緣肌動(dòng)蛋白通過(guò) Phalloidin 標(biāo)記?(綠色)，DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核?(藍(lán)色)，病毒 dsRNA 染色顯示感染細(xì)胞。A. 增殖的細(xì)胞在擴(kuò)張的類(lèi)器官中體現(xiàn)，Ki67 標(biāo)記增殖細(xì)胞?(紅色)；B. 腸上皮細(xì)胞在分化的類(lèi)器官中體現(xiàn)，APOA1 標(biāo)記有絲分裂后的腸細(xì)胞?(紅色)

看到這里，不得不稱(chēng)贊一句 Hans Clevers 類(lèi)器官培養(yǎng)玩兒得真溜！絕絕子！

相關(guān)產(chǎn)品

Wnt3a

Wnt 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、粘附、極性、細(xì)胞-細(xì)胞通信、生存和自我更新功能。Wnt3a 是類(lèi)器官構(gòu)建最常用的培養(yǎng)因子之一。

EGF

上皮組織生長(zhǎng)因子 EGF 與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)增生性變化。EGF 是胃腸道、肝臟、甲狀腺、腦等類(lèi)器官培養(yǎng)所需因子。

R-spondin-1

R-spondin-1 在干細(xì)胞的自我更新和 Wnt 信號(hào)的激活中發(fā)揮作用。它能誘導(dǎo)腸隱窩上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腸上皮愈合，支持腸上皮干細(xì)胞更新，是小鼠/人類(lèi)器官祖干細(xì)胞維持和增殖的關(guān)鍵因子。

Noggin

Noggin 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白的內(nèi)源性抑制劑，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡。它是最基礎(chǔ)的類(lèi)器官培養(yǎng)因子之一。

BMP-2、BMP-4

BMP 在胚胎發(fā)生、發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。

CHIR-99021

選擇性的 GSK3 抑制劑，可用于類(lèi)器官的生成。CHIR99021+Valproic acid?或者是 CHIR99021+LDN-193189，可協(xié)同促進(jìn) Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化狀態(tài)下的維持，得到富含 ISCs 的培養(yǎng)。

Valproic acid

HDAC 的抑制劑；在類(lèi)器官培養(yǎng)中，Valproic acid 和?CHIR99021 的組合可協(xié)同促進(jìn) Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化狀態(tài)下的維持，得到富含 ISCs 的培養(yǎng)。

LDN-193189

一種選擇性的 BMP I 型受體抑制劑，抑制 ALK2 和 ALK3 的 IC50?分別為 5 nM 和 30 nM。

IWP-2

Wnt 加工和分泌的抑制劑，其 IC50 為 27 nM。

DAPT

可抑制 Notch 1 信號(hào)傳導(dǎo)并誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

MCE?的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

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參考文獻(xiàn)

1. Nick Barker, Peter J Peters, Hans Clevers, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007 Oct 25;449(7165):1003-7.

2. Claudia Corrò, Vivian S.W. Li, et al. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.

3. Sara Rahmani, Tohid F. Didar, et al. Intestinal organoids: A new paradigm for engineering intestinal epithelium in vitro. Biomaterials. 2019 Feb;194:195-214.

4. Aliya Fatehullah, Nick Barker, et al. Organoids as an in vitro model of human development and disease.

5. Mo Li, Juan C Izpisua Belmonte. Organoids — Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579.

6. Joseph Azar, Mohamed Al-Sayegh, Wassim Abou-Kheir, et al. The Use of Stem Cell-Derived Organoids in Disease Modeling: An Update. Int J Mol Sci. 2021 Jul 17;22(14):7667.

7. HansClevers. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597.

8. Kathryn L Fair, Jennifer Colquhoun, Nicholas R F Hannan. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2018 Jul 5;373(1750):20170217.

9. Toshiro Sato, Hans Clevers, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.

10. Madeline A Lancaster, Juergen A Knoblich. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.

11. Mo Li, Juan C Izpisua Belmonte. Organoids - Preclinical Models of Human Disease. N Engl J Med. 2019 Feb 7;380(6):569-579.

12. Mart M Lamers, Hans Clevers, et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science . 2020 Jul 3;369(6499):50-54.