一、實(shí)驗(yàn)材料

微量移液器（1mL、200μL），DEPC水處理過(guò)的槍頭/EP管，Trizol試劑，氯仿，異丙醇，75%乙醇（用DEPC水配制）

二、實(shí)驗(yàn)原理

在哺乳動(dòng)物中，平均每個(gè)細(xì)胞內(nèi)大約含有10-15μg RNA，其中rRNA占總量的80%-85%，tRNA和核內(nèi)小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。Trizol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。Trizol的主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了β-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)DNA和蛋白質(zhì)的水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.?直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細(xì)胞，24孔板每孔加1?ml，用移液器吸打幾次。

2.?1ml Trizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，冰浴10 min。(注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進(jìn)行，使其充分混勻。)

3.?4℃ 12000?rpm離心5 min。樣品分為三層：底層為藍(lán)色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60%。

4.?把400-600?μl水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10?min。（異丙醇作用為沉淀RNA）。該步驟中的10?min可以縮短為5?min（貼壁細(xì)胞可以換成5?min，原代細(xì)胞10?min）。

5.?4℃ 12000?rpm離心10?min，棄上清。（離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀）(注意：該步驟很關(guān)鍵，一定要棄干凈。棄掉一次之后再甩一下用將管壁的殘留離心下來(lái)，用白槍頭吸盡殘存的液體)

6.?加入1mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀。4℃ 7600?rpm離心5 min，用槍頭吸盡殘存的乙醇。（該步驟用100%乙醇洗滌和75%乙醇洗滌差別不大，配置75%乙醇比較浪費(fèi)DEPC水）

7.?打開(kāi)離心管管蓋，室溫放置干燥，使殘存的痕量乙醇揮發(fā)殆盡，直至白色沉淀看不見(jiàn)為止即可。

8.?加20~50μl DEPC水溶解。

四、注意事項(xiàng)