自發(fā)明以來的 30 多年里，聚合酶鏈式反應 (PCR) 已成為分子生物學家的主要技術。 其不可或缺的秘訣在于其簡單性和多功能性。 該技術的許多變體已經(jīng)被開發(fā)出來； 其中之一，實時PCR，已成為基因表達定量研究、確定臨床樣本中的病原體載量以及檢測 SNP/突變的首選方法。

什么是實時 PCR？

顧名思義，實時 PCR 在每個擴增循環(huán)結束時（即實時）測量 PCR 產(chǎn)物的量。 為此，您在每個擴增循環(huán)的引物延伸步驟期間或之后標記 PCR 產(chǎn)物。

實時熒光定量PCR檢測方法

實時 PCR 中有兩種主要的 DNA 定量方法。圖1概述了這些。 一種使用 DNA 嵌入藥物或小溝靶向染料，在結合時顯示增強的熒光。 在每個擴增循環(huán)中，隨著模板 DNA 量的增加，結合的熒光團數(shù)量增加，因此熒光信號的強度增加。 流行的熒光嵌入染料包括 SYBR? Green I 和 SYBR? Gold。 它們的主要優(yōu)勢是成本，但它們是非特異性的并且結合所有 dsDNA 而不僅僅是靶標。

圖1.熒光定量PCR檢測方法

第二種方法使用熒光團標記的序列特異性 DNA 探針。 多種化學物質用于檢測。 最流行的類型使用 Taq 聚合酶的 5'-3' 核酸外切酶活性來分解寡核苷酸，該寡核苷酸分別在 5'- 和 3'- 末端具有熒光團和猝滅劑。 聚合酶的核酸外切酶活性有助于將熒光團與猝滅劑分離，從而增加熒光。 但是，如何根據(jù)熒光強度確定核酸的量呢？

從熒光信號到 DNA/RNA 定量

在反應的指數(shù)階段，熒光強度與 PCR 產(chǎn)物的量成正比，實時 PCR 中的定量依賴于這種關系。 在每個擴增循環(huán)中，熒光強度成比例增加。 如果您從模板的更多副本開始，您可以在更少的擴增循環(huán)中達到閾值熒光強度（比基線信號高 10 倍）。 達到此強度閾值所需的循環(huán)次數(shù)稱為目標 DNA 的 Ct 值。

您可以通過以下兩種方式之一使用 Ct 值。 第一，您可以將其與標準曲線進行比較，標準曲線是 Ct 值與目標 DNA 已知濃度對數(shù)的半對數(shù)圖。 然后，您可以從此圖進行插值，以確定未知樣本中目標 DNA 或 RNA 的絕對拷貝數(shù)。 第二，在同一試管中通過多重實驗共同擴增管家基因，或在單獨的實驗中擴增。

簡而言之，這就是實時 PCR。