非小細(xì)胞肺癌靶向藥物設(shè)計新策略和新方法

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，根據(jù)一份最新的報告，我國2016年的肺癌發(fā)病率發(fā)病死亡人數(shù)相對排名第二的腫瘤多出整整一倍。如果要治療腫瘤，肺癌首當(dāng)其沖。目前我國每年肺癌確診人數(shù)約80萬，占全球肺癌確診總?cè)藬?shù)的40%；相比我國人口占全球人口20%的比例是非常高的，說明肺癌對中國具有非常特殊的意義。每年因肺癌致死約61萬人，這是非常龐大的數(shù)據(jù)。但目前為止，肺癌的五年生存率小于20%，與其他腫瘤相比是非常不理想的。

這就提出了一個新問題，對于腫瘤特別是肺癌的研究需要持續(xù)深入探索它的機(jī)制和治療方法。腫瘤的生物醫(yī)學(xué)分子機(jī)制非常多，肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌里面有相當(dāng)一部分發(fā)生了EGFR激活突變，這是驅(qū)動肺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要原因。EGFR是上皮細(xì)胞生長因子受體，是在細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白。在正常細(xì)胞中，它接收到細(xì)胞外的信號分子后結(jié)合到胞外區(qū)，蛋白形成二聚體后會激活胞內(nèi)的酪氨酸肌酶結(jié)構(gòu)域，打開細(xì)胞內(nèi)的信號通路，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)的DNA擴(kuò)增、細(xì)胞增殖等一系列反應(yīng)，從而達(dá)到細(xì)胞不斷復(fù)制的效果。但是發(fā)生了這類激活突變的腫瘤細(xì)胞不需要通過外來的信號分子就可以自發(fā)地產(chǎn)生酪氨酸激酶活性，給腫瘤細(xì)胞一個信號讓它快速復(fù)制增殖，在這一類肺癌組織中，EGFR突變占有很大比例，其中一些突變就導(dǎo)致了肺癌的發(fā)生。

針對此問題，目前已經(jīng)開發(fā)了很多相關(guān)藥物，即只要阻斷EGFR胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，使酪氨酸激酶活性被阻斷，細(xì)胞就會停止復(fù)制并阻斷腫瘤細(xì)胞增殖。這都是針對于EGFR發(fā)生了19位外顯子丟失或者21位外顯子的亮氨酸到精氨酸858位突變，這些突變的效果導(dǎo)致了激酶活性的打開。目前已經(jīng)開發(fā)出了吉非替尼、厄洛替尼和奧希替尼等一系列靶向藥物。一份統(tǒng)計報告顯示，2020年中國的EGFR靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的市場已經(jīng)達(dá)到兩百多億。TKI藥物開發(fā)的早期給大家?guī)砹撕芏嘞Ｍ?，在使用的早期的確讓大家看到了靶向治療的效果，病人的狀態(tài)很快就得到顯著改善。但是使用靶向治療會存在一個很嚴(yán)重的問題；當(dāng)患者用藥一段時間后，一般是幾個月到半年的時間，藥物就會逐漸失去效果。這是因為腫瘤本身會發(fā)生基因突變，逃避已開發(fā)藥物的激活；比如第一代酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙和特羅替尼會發(fā)生T790M突變，剛開始使用時是21位的858或19號染色體等一些基因發(fā)生突變。但是用藥一段時間后腫瘤組織里面聚集了T790M的突變，第一代和第二代的靶向藥物就不能結(jié)合到酪氨酸激酶結(jié)合域，導(dǎo)致藥物失效。類比于當(dāng)前的新冠病毒，在新冠爆發(fā)早期開發(fā)了相關(guān)疫苗，但是隨著病毒的演化，這些疫苗逐漸失效。所以接下來整個領(lǐng)域開發(fā)了針對T790M的第三代TKI藥物——泰瑞沙，它能夠?qū)σ淮?、二代耐藥的腫瘤產(chǎn)生明顯的治療效果。但在用藥之后，又觀察到了新的耐藥突變——C797S。這對于藥物開發(fā)而言是非常讓人沮喪的，科研人員千辛萬苦開發(fā)出了藥物，但是病人用不了多久后就失效，又需要針對C797S設(shè)計新的靶向藥物，即第四代酪氨酸激酶抑制劑。但可以預(yù)見的是，使用一段時間后它仍然可能失效。因為腫瘤基因組非常不穩(wěn)定，會產(chǎn)生大量突變，用一段時間會再次耐藥，又要開發(fā)新的治療肺癌的靶向藥物。

那么有沒有希望從別的途徑徹底解決EGFR-TKI的耐藥問題呢？我們提出一個想法，能否通過調(diào)控EGFR蛋白酶體降解途徑的方式降解EGFR。這個思路類似于當(dāng)前非常熱門的PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向聯(lián)合體）思路，即要阻斷靶蛋白，可以把靶蛋白和細(xì)胞自身的E3泛素連接酶連在一起，通過細(xì)胞自身的蛋白酶體通路降解靶點(diǎn)，利用細(xì)胞自身的生物化學(xué)機(jī)制。

圖一. 關(guān)鍵科學(xué)問題

但是我們的工作并不是開發(fā)PROTAC藥物。在前期的工作中我們團(tuán)隊的肖志雄教授和牛孟孟博士通過大量的蛋白篩選發(fā)現(xiàn)蛋白分子FBXL2（L2）能夠降解EGFR，敲掉L2后，EGFR的含量上升；增加細(xì)胞內(nèi)L2蛋白的含量，EGFR會被降解。在生化實(shí)驗中可以非常明顯地觀察到FBXL2是EGFR的E3泛素連接酶。

圖二. E3泛素連接酶FBXL2（L2）抑制EGFR蛋白表達(dá)

基于前期工作，已知 L2能夠降解掉EGFR，那么是否有辦法上調(diào)L2的含量？已有的生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)FBXL2本身就有一個泛素連接酶——FBXO3。如果阻斷FBXO3和L2的相互作用，細(xì)胞里的L2含量上升就會幫助降解EGFR，不管EGFR是否發(fā)生耐藥，都會抑制腫瘤增殖。非常幸運(yùn)的是FBXO3的一個結(jié)構(gòu)域叫ApaG domain，目前被認(rèn)為是和L2即E3泛素連接酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，且前期研究估計到了它和L2的結(jié)合界面，所以我們的想法是開發(fā)一個小分子抑制劑阻斷蛋白-蛋白相互作用。

采用的策略是通過基于結(jié)構(gòu)、對接的藥物虛擬篩選，建立在前期開發(fā)的篩選平臺上，與基本的基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選的思路一致，一方面是對于小分子數(shù)據(jù)庫的整理，另一方面是對于靶蛋白的處理。通用思路是通過分子對接的方法發(fā)現(xiàn)能夠和目標(biāo)蛋白結(jié)合的已知小分子，并通過能量打分、人工篩選的方式挑選一個活性分子。但事實(shí)上如果用這個策略或別的軟件以及其他方法篩選，猜想是篩不到能夠阻斷FBXO3和L2結(jié)合的分子。因為目標(biāo)蛋白FBXO3的ApaG domain的晶體結(jié)構(gòu)是自由狀態(tài)晶體結(jié)構(gòu)，沒有和目標(biāo)蛋白相互作用狀態(tài)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，它的口袋形式和它的結(jié)合分子形式是不一樣的。在前期分析中大體上能確定FBXO3和L2結(jié)合的界面是比較淺的口袋，大概是分成兩個部分，左邊和右邊各一個小口袋，中間有一些凸起的氨基酸。如果直接用晶體結(jié)構(gòu)做分子對接，很難找到一個匹配好的分子，因為口袋中央有一個關(guān)鍵氨基酸——E341谷氨酸，它擋住了小分子結(jié)構(gòu)結(jié)合的空腔。在做設(shè)計以及篩選時需要通過前期的模擬，一方面是通過分子動力學(xué)對結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，另一方面是通過前面做的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測多構(gòu)象的計算方法I-TASSER。在這個結(jié)合模式上做了大量的構(gòu)象篩選和搜索后得到了比較好的結(jié)合模式，不僅能夠把口袋的空腔打得更開，而且末端的羧基集團(tuán)朝向也比較合理，分子也可以和E341形成比較好的氫鍵連接。

圖三. 小分子藥物虛擬篩選

通過前期的處理得到了一系列分子，這個工作采用了DrugBank里面的小分子，包括臨床用小分子和實(shí)驗用小分子。DrugBank收錄了已知的政府藥品監(jiān)督管理部門和各國已經(jīng)批準(zhǔn)的藥物以及已經(jīng)在臨床或?qū)嶒炆鲜褂玫姆肿?。篩選找到比較匹配狀態(tài)的分子并不多，DrugBank數(shù)據(jù)庫也比較小，通過能量打分和篩選后只找到三個目測還不錯的分子。在計算過程中用到了前期開發(fā)的一些計算工具如疏水能計算和親和力計算的算法，使疏水能的計算結(jié)果更加精確，因為小分子-蛋白或蛋白-蛋白相互作用中疏水作用起到驅(qū)動力的作用，所以對它的刻畫十分重要。根據(jù)一些物理化學(xué)研究，疏水作用和分子表面曲率有關(guān)，同樣的疏水氨基酸在凹陷區(qū)域比凸起區(qū)域產(chǎn)生的疏水作用、疏水能量更強(qiáng)。所以提出了一個計算方法，通過對分子表面的計算單元進(jìn)行表面曲率的權(quán)重控制，使它并不是一個簡單的線性關(guān)系，從而更好地估計分子相互作用時疏水能的損失，此法計算蛋白-配體親和力的準(zhǔn)確性得到較好提升。計算過程中篩選分子對接口袋時，需要優(yōu)化對接口袋的參數(shù)估計。眾所周知，做分子對接要明確分子對接口袋的中心和范圍，范圍要根據(jù)分子大小進(jìn)行調(diào)整，我們做了一個比較好的優(yōu)化模型使篩選過程更加順利。當(dāng)篩選了一些比較好的分子或有目標(biāo)結(jié)構(gòu)時，可以通過分子指紋或其他分子相似性的方法富集活性分子，這就提出了一種多指標(biāo)包括一維、二維分子指紋、三維結(jié)構(gòu)信息整合在一起的分子相似性的度量方法，在基于分子相似性的活性分子篩選中的效果十分顯著。

圖四. 計算工具和方法

通過以上工作找到了三個活性分子，包括治療高血壓的藥物腎上腺激素β1受體阻斷劑奈必洛爾、精神病治療藥物氟班色林以及HIV整合酶抑制劑拉替拉韋鉀。這三個分子都是根據(jù)前面已有文獻(xiàn)以及自己分析設(shè)想的口袋，因為到目前為止沒有一個復(fù)合物結(jié)構(gòu)或明確的數(shù)據(jù)證明小分子一定會結(jié)合到此區(qū)域。圖五中可以看到篩選的分子在結(jié)合上，結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和特征互補(bǔ)性比較明顯。首先這些分子都是長條形且左右各一團(tuán)，分別結(jié)合在口袋和兩塊凹陷區(qū)，中間部分會和E341谷氨酸形成較好的氫鍵連接，第一個分子奈必洛爾有比較強(qiáng)的對稱性。通過實(shí)驗鑒定三個分子是否有效，在細(xì)胞實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)奈必洛爾有明顯下調(diào)EGFR的效果，所以猜測奈必洛爾可以阻斷FBXO3-FBXL2的相互作用，提升細(xì)胞內(nèi)EGFR泛素連接酶L2的含量以此幫助降解EGFR，這個目標(biāo)達(dá)到了。如果分子加進(jìn)來后阻斷了FBXO3對L2的降解，L2沒有降解而是進(jìn)一步降解EGFR，且不同濃度下對于EGFR的降解有明顯的梯度效果。另外兩個分子在實(shí)驗上沒有觀察到效果，所以對奈必洛爾進(jìn)行進(jìn)一步研究，通過免疫共沉淀（CoIP）實(shí)驗證明奈必洛爾確實(shí)結(jié)合在FBXO3上，幫助解除它和L2的相互作用。在結(jié)合模式上對結(jié)構(gòu)進(jìn)行更細(xì)致的模擬，能夠明確它們相互作用的關(guān)鍵氨基酸，實(shí)驗結(jié)果表明突變掉關(guān)鍵氨基酸后相互作用效果全部丟失。

圖五. 篩選得到的三個分子

對發(fā)生第一代、第二代耐藥的突變細(xì)胞制作了小鼠異種腫瘤移植模型，觀察發(fā)現(xiàn)不對小鼠進(jìn)行腹腔注射奈必洛爾，小鼠肺部的腫瘤組織在非常明顯的不斷增大；使用奈必洛爾后過一段時間觀察到小鼠的肝臟、肺部非常干凈，腫瘤體積明顯減小。對已經(jīng)發(fā)生第三代TKI耐藥的肺癌組織進(jìn)行實(shí)驗，結(jié)果表明單獨(dú)使用奈必洛爾對發(fā)生耐藥突變的情況也有抑制效果；聯(lián)用第三代TKI藥物泰瑞沙，效果進(jìn)一步增加。為進(jìn)一步確證這個過程是通過L2途徑發(fā)生，在移植瘤內(nèi)敲掉L2發(fā)現(xiàn)奈必洛爾或奈必洛爾聯(lián)用泰瑞沙的效果全部丟失。一系列細(xì)胞和動物實(shí)驗都反映了通過L2途徑降解EFGR是一個非常有效的方法，抗高血壓藥奈必洛爾可以起到預(yù)想的調(diào)控L2從而降低EGFR的效果。

圖六. 奈比洛爾可克服奧希替尼耐藥性

綜上，通過靶向EGFR的蛋白降解實(shí)現(xiàn)了非小細(xì)胞肺癌的治療，與目前大部分通過EGFR酪氨酸激酶抑制劑的方案相比完全不同，即便發(fā)生了大量的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的各種突變，此法仍然有效。這也揭示了一個新途徑以及EGFR的E3泛素連接酶L2的重要作用，更重要的是通過計算機(jī)輔藥設(shè)計方法采取了一系列的新策略，能夠進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)治療效果。

我們課題組關(guān)注更多的是計算機(jī)輔助藥物設(shè)計或分子設(shè)計相關(guān)的算法研究，也開發(fā)的一些算法和軟件，包括計算蛋白配體親和力的計算打分函數(shù)CYSCORE、分子自動對接方法CB-DOCK2、老藥新用的計算平臺DrugRep、基于分子匹配的對接方法FitDock以及分子相似性的計算方法LigMate，這些工具都是可以在我們的網(wǎng)站上（http://www.labshare.cn ; http://cao.labshare.cn）下載使用。同時還有相關(guān)的蛋白藥物的計算、分析，包括針對抗體CDR識別的計算方法AbRSA以及新近開發(fā)的從BCR數(shù)據(jù)提取有效的抗體的新方法Abalign。在蛋白方面，包括蛋白結(jié)構(gòu)優(yōu)化的方法CIS-RR、二硫鍵的設(shè)計方法DBdesign、蛋白設(shè)計工具Protein Tools。目前在全世界范圍內(nèi)有很多人在使用這些工具，平均每天使用的用戶有兩百多個，登記的用戶包括高校、研究機(jī)構(gòu)、企業(yè)等。

下面介紹兩個今年發(fā)布的工作——FitDock和CB-Dock2。第一個是藥物分子的優(yōu)化設(shè)計的新方法FitDock，這工具是什么呢？假設(shè)已經(jīng)知道了一個分子、目標(biāo)蛋白、目標(biāo)靶點(diǎn)是結(jié)合的且知道結(jié)合模式，結(jié)合模式可以是已有的蛋白-小分子復(fù)合物或通過分子對接等計算方法獲得的結(jié)合模式。希望在苗頭分子基礎(chǔ)上通過替換不同基團(tuán)、改變骨架等方式進(jìn)行改造，觀察新的分子能否更加有效。此思路和自由能微擾有一點(diǎn)近似，是基于既有的分子結(jié)構(gòu)模式，把預(yù)測的分子替換一些基團(tuán)或少量替換一些骨架和原有的結(jié)合模式進(jìn)行匹配，分析新的模式相對原有模式帶來的能量差異。針對此法，我們建立了一套匹配算法并得到比較好的效果。在測試?yán)锩婵梢钥吹?，如果有一個目標(biāo)分子可以作為模板，那么相比目前已有的各種方法，此法的分子對接準(zhǔn)確性已經(jīng)達(dá)到整個領(lǐng)域最高水平。

以上是基于模板的分子相似性的對接計算方法，另外一個是分子的盲對接方法CB-Dock2。CB-Dock2是在幾年前開發(fā)的分子自動化對接工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行了升級。分子對接的手續(xù)非常麻煩，要做各種準(zhǔn)備工作如找口袋、中心、范圍、調(diào)整分子的各種參數(shù)，前期的工作需要把很多計算模型整合到一起，一些自有算法可以把整個過程變成自動化的計算。新升級的方法可以把前面的基于模板的Fitdock整合進(jìn)去，現(xiàn)階段通過大量實(shí)驗方法已經(jīng)解析了蛋白配體的很多復(fù)合物結(jié)構(gòu)，特別是很多熱門的藥物靶點(diǎn)，這時如果要做分子對接，可以不需要完全自由的狀態(tài)去對接，而是參考已有的對接模式，把它置換到已有的結(jié)合分子上觀察結(jié)合模型。新升級的方法在計算對接準(zhǔn)確率上有明顯提升，從之前的69.4%提升到85%，對接分子的構(gòu)象相對于真實(shí)的晶體構(gòu)象偏差很小。對比整個領(lǐng)域進(jìn)行分子自由狀態(tài)的盲對接方法，這個新方法的成功率最高，相比其他方法存在顯著差異，這個工具是一個用戶友好的在線工具，可以在服務(wù)器網(wǎng)站上上傳蛋白、分子或者自己繪制一個希望對接的分子或在已知的分子基礎(chǔ)上調(diào)整分子結(jié)構(gòu)，這對于分子的設(shè)計特別是苗頭分子的改造是非常方便的，上傳苗頭分子后通過在線網(wǎng)站上的分子自由繪制工具得到新的分子，點(diǎn)擊提交后無需設(shè)置其他參數(shù)就可以進(jìn)行分子對接的計算，幾分鐘后即可得到計算結(jié)果。它包含了兩種模式，一個模式是基于自由狀態(tài)的對接，另一個是基于模板的對接，各個模式里預(yù)測了各個口袋、對接模型、對接打分、對接參數(shù)、對接中的關(guān)鍵氨基酸，這些信息都可以提供，用戶通過在線三維結(jié)構(gòu)顯示窗口進(jìn)行觀察和分析得到的結(jié)果是否可靠或提供的信息是否有用。如果在對接過程中使用了模板分子，也可以在上面觀察原始分子和對接分子之間的差別在哪里，從而更好地評估對接結(jié)果是否可信。

圖七. CB-Dock2的對接準(zhǔn)確率及使用

課后提問與回答：

Q1：L2是將所有的EGFR都降解嗎？這樣會影響正常的生理功能嗎？如果不是針對所有的EGFR，那如何識別到突變的EGFR呢？

答：一個關(guān)鍵問題是這個藥物是不是對于正常細(xì)胞也有傷害。在肺癌細(xì)胞里面EGFR是高度表達(dá)的，特別是EGFR相關(guān)的L2。用藥會對正常細(xì)胞會有一些影響，但是可以看到在腫瘤組織里面EGFR是高度表達(dá)受影響的蛋白；對于調(diào)控，在正常組織和腫瘤組織里面存在顯著差異。所以對于腫瘤患者而言，為了獲得更好的療效，可以容忍L2降低EFGR。但是在動物實(shí)驗中，我們用了大量的奈必洛爾也沒有看到小鼠的機(jī)體變化，無論是體重、身體狀態(tài)都是正常的。對于野生型和突變型不存在選擇性都有效果。目前在現(xiàn)有的分子基礎(chǔ)上已經(jīng)設(shè)計了一些新的分子，活性得到很大提升。

Q2：在動物實(shí)驗中，奧希替尼和奈必洛爾的濃度是如何確定的？蛋白降解用的10微摩爾以及20微摩爾濃度相對比較大，在動物實(shí)驗中能達(dá)到有效的降解濃度嗎？

答：是的，由于這個分子本身是老藥新用，它本身其實(shí)并不是結(jié)合FBXO3。奈必洛爾本身是β1受體阻斷劑，所以結(jié)合在目標(biāo)結(jié)構(gòu)上的活性不是特別高，我們測試到的IC50大概是9微摩爾左右，并不是特別理想的活性狀態(tài)。但是在動物實(shí)驗或細(xì)胞實(shí)驗中的效果非常明顯，一個原因是它并不像其他抑制劑一樣直接抑制目標(biāo)分子，對劑量要求非常高。因為L2對于EGFR的降解效果非常明顯，只要少量提高L2，EGFR降解就非常顯著。所以即便分子本身量不太高，也得到了比較好的效果。在動物實(shí)驗中，用藥量大概是50毫克的劑量，但這是我們團(tuán)隊做實(shí)驗的老師同學(xué)來完成的，這部分我不是特別熟悉。這樣的濃度在動物上看不到特別的影響，還可以提高劑量。

Q3：如果降解分子和抑制劑分子聯(lián)合用藥，最后的結(jié)果一定是協(xié)同作用嗎？是否會出現(xiàn)某一個分子的效果覆蓋另外一個效果的情況？

答：這個問題非常重要，相互作用是不是真正的產(chǎn)生協(xié)同作用，在我們的實(shí)驗結(jié)果里面不能給出完整的答案，但是從數(shù)據(jù)上看到的效果，假如對于PC-9做了T790M和797位點(diǎn)的突變，泰瑞沙是完全失活的，只使用泰瑞沙的效果和對照組的效果是一樣的，但是只用奈必洛爾是有效果的，聯(lián)合用藥后效果進(jìn)一步增強(qiáng)。從這個角度上講，我們認(rèn)為存在協(xié)同關(guān)系。但是進(jìn)一步的機(jī)制還需要更深入的研究，因為L2通路還有很多其他影響的蛋白。

Q4：L2除了降解EGFR會降解其他的靶點(diǎn)蛋白嗎？

答：會。關(guān)于L2的相關(guān)研究，我們團(tuán)隊的牛孟孟博士最近做了很多工作，其實(shí)它有很多相關(guān)調(diào)控通路。但是在這個工作中，最主要的是EGFR通路，其他調(diào)節(jié)功能可能會在今后的研究報告中公布給大家。

Q5：曹老師如何看待酪氨酸激酶藥物的發(fā)展前景？

答：在剛才的報告中提到了酪氨酸激酶會產(chǎn)生耐藥，這是靶向藥物的一個普遍問題，對于腫瘤這種基因組穩(wěn)定性很差的對象，藥物發(fā)生耐藥是很自然的情況。其實(shí)就是在不斷地作斗爭，發(fā)生耐藥后想辦法克服。所以從長期角度或者相當(dāng)長一段時間而言，我覺得TKI有比較大的市場前景。或許在未來較長一段時間甚至更長一段時間內(nèi)之后，可能發(fā)現(xiàn)新的方式實(shí)現(xiàn)不依賴TKI就可以達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞增殖目的的藥物，這當(dāng)然是更好的。但是到目前為止，即便是使用奈必洛爾或進(jìn)一步衍生的新的分子仍然需要很長時間的研究才能夠得到一個比較好的滿意效果。所以在可以預(yù)見的未來TKI是很重要的，而且可以看到藥物和TKI聯(lián)用是有效果的，所以不管是單獨(dú)或聯(lián)用使用對于肺癌的治療都是非常有效的。

Q6：開發(fā)第四代的EGFR抑制劑，為了克服奧希替尼的耐藥性，就要求第四代的抑制劑對于野生型的EGFR沒有抑制活性，對突變型要有選擇性，那阻斷L2會不會有潛在的很大的毒副作用？

答：如果L2已經(jīng)降解了EGFR，那么第四代藥物就沒有靶點(diǎn)了，就不會有副作用這是理想情況。假如第四代的藥物降解了EGFR，我們的藥物再加進(jìn)來，此時L2會通過其他通路起作用，這時可能會有一些副作用。但是L2途徑通路對于身體、細(xì)胞的生長或者其他功能機(jī)制研究目前還不清晰，所以還需要進(jìn)一步研究才能夠得到更準(zhǔn)確的回答。但不管第三代或第四代都可能有這樣的問題。

Q7：一代、二代EGFR抑制劑50%左右會產(chǎn)生790甲硫氨酸突變，另外的50%其實(shí)是無藥可用的。這個策略對于另外的50%是否也有效？

答：另外的50%有很多原因，假如這50%里面有一些產(chǎn)生了不依賴EGFR激活，但是下游仍然可以激活這種通路的突變，那我們的藥物就沒有效果了；假如50%里面存在一些仍然是導(dǎo)致了酪氨酸激酶活性激活，但是并不包含在T790M上，那么藥物是有效的。要看這50%里面是不是EGFR驅(qū)動的腫瘤，如果不是EGFR驅(qū)動的，就沒有效果。

Q8：針對您開發(fā)的軟件，用于藥物分子優(yōu)化的自由能微擾(FEP)和Fitdock比較的話，效率和準(zhǔn)確度上的優(yōu)勢如何？

答：Fitdock只是一個快速簡易的工具，它是比較粗略化的評估結(jié)合模式，評估基團(tuán)調(diào)整之后相互作用帶來的影響。自由能微擾(FEP)是做非常大量的動力學(xué)模擬、對構(gòu)象的各種狀態(tài)進(jìn)行充分的采樣，所以自由能微擾(FEP)比Fitdock要強(qiáng)很多，但是對于高通量或大批量的計算而言，F(xiàn)itdock能夠得到一個先期的結(jié)果，可以提供預(yù)先的提示，我想這兩種方法應(yīng)該是可以結(jié)合使用的。

Q9：您開發(fā)的這些對接平臺可以用于小分子和核酸藥物靶點(diǎn)的對接嗎？

答：非常遺憾，我覺得我們的方法對于核酸可能是不太適用的。因為核酸分子本身有比較高的柔性，它是一個含有可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量非常多的長鏈。雖然我們的方法支持小分子柔性的自由旋轉(zhuǎn)，但是柔性相關(guān)的可旋轉(zhuǎn)鍵太多，采樣效率會非常低。我覺得針對于蛋白、核酸分子對接應(yīng)該使用一些專門的工具。算法領(lǐng)域會有相關(guān)團(tuán)隊正在往這方面努力，希望能夠?qū)τ诘鞍?配體、蛋白-核酸對接得到更好的效果。從計算上，假如核酸很小很短，就只有幾個堿基，我們的工具應(yīng)該可以進(jìn)行對接，只是個人評估對于結(jié)合以及準(zhǔn)確性而言可能是不利的。

Q10：用于老藥新用的DrugREP是如何工作的呢？它的算法是什么？

答：DrugREP是整合了基于受體或配體的計算。假如有一個受體結(jié)構(gòu)，那么會自動的在已有的藥物庫包括Drugbank、中藥分子庫里面進(jìn)行對接篩選，幫助判斷這個靶點(diǎn)是否有藥物-蛋白相互作用。另外一方面結(jié)合了前面相似性的計算模型LigMate、FitDock以及一些分子指紋的方法幫助查找基于現(xiàn)有的活性分子在已有的藥物里面能不能找到跟它有共有特征的分子，可以給你一些提示這個老藥是否可以用在新的場合。這工作正在投稿中，下半年大家可能可以看到。

Q11：對您課題組的研究感興趣，想問您課題組招收申請考核博士嗎？之前沒有CADD的基礎(chǔ)，從事的是純深度學(xué)習(xí)的算法開發(fā)工作比如計算機(jī)視覺、聲學(xué)以及少量自然語言處理。

答：歡迎計算機(jī)背景的同學(xué)報考我們實(shí)驗室，博士是接受申請的。但是有一些條件，要看具體每年的研究生院提出的一些基本條件能否達(dá)到。