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2021年12月21日，美國(guó)阿肯色大學(xué)、德克薩斯大學(xué)和肯塔基大學(xué)的研究人員合作在《Aging Cell》雜志發(fā)表了題為“Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging”的Short Take研究論文，該研究通過(guò)使用簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS）、核糖體DNA（rDNA）和線粒體特異性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和DNAge? 表觀遺傳衰老時(shí)鐘分析對(duì)小鼠自愿耐力/阻力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（漸進(jìn)式負(fù)重輪跑，PoWeR）的可翻譯模型，揭示運(yùn)動(dòng)可以延緩骨骼肌的表觀遺傳衰老。

標(biāo)題：Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging晚年鍛煉延緩骨骼肌表觀遺傳衰老

時(shí)間：2021.12.21

期刊：Aging Cell

影響因子：IF 11.005

技術(shù)平臺(tái)：RRBS等

樣本實(shí)驗(yàn)：

研究摘要：

包括骨骼肌在內(nèi)的所有組織在整個(gè)生命周期中都會(huì)發(fā)生DNA甲基化變化，且結(jié)構(gòu)和功能可能隨著年齡增長(zhǎng)而下降。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練會(huì)改變肌肉DNA甲基化，但是否會(huì)導(dǎo)致老年小鼠骨骼肌甲基化更接近年輕小鼠的甲基化尚不清楚。本研究對(duì)22-24月齡小鼠進(jìn)行漸進(jìn)式負(fù)重輪跑（PoWeR）的高容量阻力/耐力訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后，通過(guò)RRBS甲基化測(cè)序分析、核糖體DNA（rDNA）和線粒體特異性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和＞500個(gè)組織特異性小鼠CpG位點(diǎn)的高覆蓋率表觀遺傳衰老時(shí)鐘分析（DNAge?分析），評(píng)估運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌表觀遺傳衰老的作用，并將結(jié)果與Horvath泛組織表觀遺傳衰老時(shí)鐘進(jìn)行重疊分析。結(jié)果表明22-24月齡的晚年小鼠PoWeR顯著減緩了與年齡相關(guān)的啟動(dòng)子甲基化變化。PoWeR訓(xùn)練8周后的老年小鼠（aged?PoWeR）肌肉表觀遺傳年齡大約比24月齡的久坐小鼠（aged sedentary）年輕8周，約占預(yù)期小鼠壽命的8%。這些數(shù)據(jù)為運(yùn)動(dòng)減緩骨骼肌衰老提供了分子基礎(chǔ)。

研究結(jié)果

（1）骨骼肌的RRBS分析

與4月齡年輕小鼠相比，久坐的24月齡小鼠腓腸肌的啟動(dòng)子區(qū)域（即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 kb內(nèi)）的103個(gè)特異性CpG位點(diǎn)低甲基化（FDR＜0.05），而比對(duì)到133個(gè)不同基因中至少一個(gè)基因?qū)?yīng)的762個(gè)不同CpG位點(diǎn)高甲基化（FDR<0.05，圖1a）。對(duì)老年肌肉高甲基化啟動(dòng)子基因的通路分析表明，三羧酸循環(huán)（TCA）調(diào)節(jié)（p=0.00572，q=0.125）中的過(guò)表達(dá)，特別是與NAD活性相關(guān)的基因（圖1b）。在外顯子區(qū)域比對(duì)到27個(gè)基因中至少一個(gè)基因?qū)?yīng)的68個(gè)CpG位點(diǎn)表現(xiàn)出低甲基化，而比對(duì)到146個(gè)基因中至少一個(gè)基因?qū)?yīng)的864個(gè)不同CpG位點(diǎn)在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（FDR<0.05，且老年久坐小鼠的內(nèi)含子甲基化模式相同；比對(duì)到131個(gè)基因中至少一個(gè)基因?qū)?yīng)的271個(gè)CpG位點(diǎn)低甲基化；而比對(duì)到301個(gè)基因中的至少一個(gè)基因?qū)?yīng)的2261個(gè)CpG位點(diǎn)高甲基化（FDR<0.05）。隨著年齡的增長(zhǎng)，所有三個(gè)區(qū)域中（啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子）沒(méi)有基因隨著年齡而低甲基化，而所有三個(gè)區(qū)域中有18個(gè)基因高甲基化。

圖1：年輕、老年久坐和老年漸進(jìn)式負(fù)重輪跑（PoWeR）小鼠肌肉中啟動(dòng)子甲基化變化。

（a） 老年久坐小鼠與年輕小鼠腓腸肌中啟動(dòng)子CpG甲基化百分比（距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)≤1 kb）（所有位點(diǎn)*FDR<0.05；相同CpG的老年P(guān)oWeR甲基化顯示為參考）。

（b） 與年輕小鼠相比，三羧酸（TCA）循環(huán)基因啟動(dòng)子隨年齡增長(zhǎng)而高甲基化，插圖顯示啟動(dòng)子CpG平均甲基化。

（c） 與年輕小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化，但老年P(guān)oWeR小鼠中的基因未低甲基化。

（d） 與年輕小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，老年P(guān)oWeR小鼠中的基因未高甲基化。

（e） Rbm10和Timm8a1啟動(dòng)子區(qū)甲基化；x軸表示基因啟動(dòng)子區(qū)中單個(gè)CpG位點(diǎn)的染色體位置。使用所有組的廣義線性模型來(lái)確定差異甲基化，通過(guò)使用Benjamini–Hochberg方法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來(lái)校正多重比較（α=0.05）

（2）核糖體DNA（rDNA）甲基化和DNAge?分析

rDNA隨著年齡的增長(zhǎng)而高甲基化，并具有高度保守的衰老甲基化時(shí)鐘。本研究在rDNA中鑒定出360個(gè)CpG位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在老年小鼠和年輕小鼠肌肉中差異甲基化（FDR<0.05），其中15個(gè)位點(diǎn)低甲基化，345個(gè)位點(diǎn)高甲基化。在PoWeR訓(xùn)練后，久坐小鼠中有9個(gè)位點(diǎn)低甲基化（圖2a）。PoWeR訓(xùn)練將老年小鼠與年輕小鼠肌肉中11個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平向年輕小鼠轉(zhuǎn)移（圖2b）。對(duì)增強(qiáng)子區(qū)域位點(diǎn)（CpG 43519）及其周圍的甲基化水平使用靶向高分辨率甲基化分析（平均每個(gè)rDNA CpG的覆蓋率>10000倍），結(jié)果表明與單獨(dú)衰老相比，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的更多甲基化水平，這些位點(diǎn)在年輕小鼠中無(wú)論運(yùn)動(dòng)與否均呈現(xiàn)高甲基化水平。從RRBS分析可以得出結(jié)論，運(yùn)動(dòng)可以改變老年肌肉中的rDNA甲基化，但靶基因分析揭示了reads覆蓋度對(duì)絕對(duì)甲基化水平的潛在影響（位點(diǎn)43519的RRBS覆蓋度平均為23倍）。

圖2：核糖體DNA（rDNA）甲基化和DNAge? 分析。

（a） 與年輕小鼠相比，rDNA CpG（按染色體位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中低甲基化（*FDR<0.05），但在老年P(guān)oWeR小鼠肌肉中未低甲基化。

（b） 與年輕小鼠相比，rDNA CpG（按染色體位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（*FDR<0.05），但在老年P(guān)oWeR小鼠肌肉中未高甲基化。

（c） 老年久坐小鼠與老年P(guān)oWeR小鼠肌肉的DNAge?分析，使用定向t檢驗(yàn)分析。使用所有組的廣義線性模型來(lái)確定（a）和（b）中的差異甲基化，并通過(guò)使用Benjamini-Hochberg方法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來(lái)校正多重比較（α=0.05）；直方圖用直線表示中位數(shù)。

PoWeR訓(xùn)練8周后的DNAge?分析對(duì)研究小鼠腓腸肌中年輕的表觀遺傳年齡足夠敏感，最近的進(jìn)展有望提高肌肉特異性甲基化的衰老時(shí)鐘的穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性。未來(lái)的研究可能會(huì)闡明哪些運(yùn)動(dòng)對(duì)DNAge的影響與衰老無(wú)關(guān)。在某些情況下，與其他相關(guān)因素（如體重或心肺功能）相比，年齡與肌肉功能障礙的相關(guān)性較小。不過(guò)運(yùn)動(dòng)對(duì)減緩肌肉表觀遺傳衰老的研究結(jié)果支持了最近對(duì)人類的針對(duì)性觀察，且越來(lái)越多的證據(jù)表明運(yùn)動(dòng)是延長(zhǎng)健康壽命的一種策略。一旦肌肉纖維中動(dòng)態(tài)DNA甲基化變化機(jī)制基礎(chǔ)得到更明確的定義，隨著年齡增長(zhǎng)，改善肌肉健康將成為潛在可修飾的表觀遺傳標(biāo)記。

關(guān)于易基因簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）研究解決方案

簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，富集啟動(dòng)子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測(cè)序深度，在CpG島、啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。

為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開(kāi)發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向基因組測(cè)序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測(cè)，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)15M以上。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 起始量：100ng gDNA；

• 單堿基分辨率；

• 多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%、測(cè)序區(qū)域針對(duì)高CpG調(diào)控區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高；

• 針對(duì)性強(qiáng)，成本較低；

• 基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)10-15M，顯著優(yōu)于850K芯片。

應(yīng)用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應(yīng)用于動(dòng)物，要求全基因組掃描（覆蓋關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)）的：

• 隊(duì)列研究、疾病分子分型、臨床樣本的甲基化 Biomarker 篩選

• 復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)病機(jī)制等甲基化研究

• 模式動(dòng)物發(fā)育和疾病甲基化研究

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參考文獻(xiàn)：

Klughammer J, et al. Comparative analysis of genome-scale, base-resolution DNA methylation profiles across 580 animal species. Nat Commun. 2023 Jan 16;14(1):232.