凝膠阻滯(實驗簡介,實驗步驟)
一,凝膠阻滯實驗簡介:
※ 凝膠阻滯實驗是通過檢測質(zhì)粒的結(jié)合能力以及脂質(zhì)體,進而達(dá)到影響轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果。該實驗一般應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的DNA以及蛋白質(zhì)RNA的相互作用,在實驗對照泳道過程中(不含蛋白質(zhì)的DNA / RNA探針)將通過條帶進而顯現(xiàn)出來結(jié)果。
二,凝膠阻滯實驗所需材料及試劑:
10ul白吸頭(滅菌) ,0.5ml尖底連蓋離心管 ,Agarose,過硫酸銨,丙烯酰胺
三,凝膠阻滯實驗步驟:
1.聚丙烯酰胺凝膠的制備
(1)將干凈的夾具,配板和墊片組裝。用膠帶密封側(cè)面和底部(防止凝膠漏出)
(2)聚丙烯酰胺凝膠5%的制備步驟:
產(chǎn)品名稱體積:MediumH2O78毫升39毫升10×TBE 5毫升2.5毫升30%丙烯酰胺(19:1)16.6 毫升8.4 毫升10%過硫酸銨1000 微升500 微升
(3)充分混合以減少泡沫的形成,加入10%的瓊脂糖,100微升?/ 50微升TEMED。
(4)混合后,將其倒入橡膠片中并插入梳子,約15分鐘膠體凝固。
(5)凝固后,可以將凝膠包裹在塑料膜中放在4℃環(huán)境下保存。
2.準(zhǔn)備5X結(jié)合緩沖液。
3.組合反應(yīng):
①?1微升poly-dIdC(1微克/微升)
②?2μl5x結(jié)合緩沖液
③?1 微升標(biāo)記探針+0.1微升100xBSA
⑤ 加入體積(微升)核提取物(總蛋白5ug)
⑥?將H2O添加到10 微升總體積中
⑦?加入適量抗體(使阻滯更加明顯),在室溫下30min。
4.在結(jié)合反應(yīng)性自由基的過程中,將凝膠安裝到電泳槽中,在150伏的0.5×TBE電泳緩沖液中預(yù)運行30min,然后在150 V的電壓下加載樣品和電泳2小時。
5.制作干膠(可選):將膠轉(zhuǎn)移到濾紙上。用膠水覆蓋濾紙,并在80°C的真空干燥機中干燥1-2小時。
6.在暗室中擠壓并曝光膠卷,并將膠卷放入暗盒中,暴露于-80°C。