無(wú)載體納米前藥可經(jīng)EPR效應(yīng)聚集于腫瘤部位，同時(shí)兼具超高載藥量和控釋等優(yōu)點(diǎn)，作為新興的藥物遞送系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注。然而，與諸多其他納米藥物一樣，無(wú)載體納米前藥在腫瘤部位和腫瘤細(xì)胞中的蓄積不足是限制其臨床轉(zhuǎn)化的一大難題；此外，腫瘤微環(huán)境中常見(jiàn)內(nèi)源性刺激水平含量不夠高且分布不均勻，難以有效實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)和特異釋放。維生素E琥珀酸酯(VES)可作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物II快速產(chǎn)生大量ROS以產(chǎn)生氧化應(yīng)激；甲氨蝶呤(MTX)既可發(fā)揮化療功效又可發(fā)揮靶向作用。有鑒于此，我們將兩者結(jié)合，合成腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)VES-N=CH-PEG和腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS響應(yīng)VES-Se-Se-MTX兩種藥物前體基元，自組裝構(gòu)建一種腫瘤微環(huán)境級(jí)聯(lián)響應(yīng)納米前藥，可依次通過(guò)自靶向激活和ROS循環(huán)放大，實(shí)現(xiàn)納米藥物于腫瘤部位和腫瘤細(xì)胞的高效蓄積與特異釋放，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤氧化-化療協(xié)同療效的增強(qiáng)。

Tumor Microenvironment Cascade?Responsive Nanodrug with Self?Targeting Activation and ROS Regeneration for Synergistic Oxidation?Chemotherapy

Yang Li#, Jinyan Lin#, Peiyuan Wang, Qiang Luo, Fukai Zhu, Yun Zhang, Zhenqing Hou, Xiaolong Liu*, Jingfeng Liu*

Nano?Micro Lett.(2020)12:182

https://doi.org/10.1007/s40820-020-00492-4

本文亮點(diǎn)

1.?構(gòu)建了一種兼具自靶向激活和ROS循環(huán)放大功能的pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)維生素E納米前藥。

2.?納米前藥可響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性ROS按需釋放維生素E琥珀酸酯，繼而作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物II產(chǎn)生外源性ROS，通過(guò)正反饋循環(huán)進(jìn)一步加速納米前藥解體，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的特異釋放。

3.?納米前藥可通過(guò)氧化療法和化療的有序組合實(shí)現(xiàn)腫瘤的高效協(xié)同治療。

內(nèi)容簡(jiǎn)介

中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所&福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院劉小龍、劉景豐團(tuán)隊(duì)基于腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS響應(yīng)維生素E琥珀酸酯-甲氨蝶呤前體藥物(VES-Se-Se-MTX)的自組裝和腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)維生素琥珀酸酯-PEG(VES-N=CH-PEG)的表面嵌入，開(kāi)發(fā)了一種兼具自靶向激活和ROS循環(huán)放大功能的pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)無(wú)載體納米前藥。

聚乙二醇(PEG)冠包被于表面可掩蔽MTX的靶向性能，避免藥物被免疫系統(tǒng)清除。納米前藥經(jīng)長(zhǎng)循環(huán)聚集至腫瘤部位后，可響應(yīng)微酸環(huán)境導(dǎo)致PEG冠脫落，從而暴露MTX靶向配體，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)其的特異攝??；隨后腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性ROS可觸發(fā)二硒鍵斷裂，從而導(dǎo)致納米前藥分解；從中釋放出來(lái)的VES可作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物II，產(chǎn)生大量外源性ROS，繼而通過(guò)正反饋循環(huán)進(jìn)一步加速藥物釋放。借助于自靶向激活和ROS循環(huán)放大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，納米前藥經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，可高效蓄積于腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異藥物釋放，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤氧化-化療協(xié)同療效的增強(qiáng)。

圖文導(dǎo)讀

I?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的構(gòu)建

維生素E琥珀酸酯(VES)是一種重要的維生素E酯類(lèi)衍生物。諸多文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)VES能高度選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，卻對(duì)正常人體細(xì)胞及組織幾乎沒(méi)有毒性。最近研究發(fā)現(xiàn)，VES能夠特異靶向攻擊腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體，作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物II誘導(dǎo)活性氧(ROS)快速產(chǎn)生和積累(圖1a)。另外，由于甲氨蝶呤(MTX)與葉酸(FA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度類(lèi)似，相異之處在于FA蝶啶環(huán)4位基團(tuán)為羥基，而MTX則為氨基，MTX既可作為抗腫瘤藥物，也可作為靶向配體(圖1b)。有鑒于此，我們合成了ROS響應(yīng)VES-Se-Se-MTX和pH響應(yīng)VES-N=CH-PEG兩種藥物前體，基于VES-Se-Se-MTX的自組裝和VES-N=CH-PEG的表面嵌入，構(gòu)建了一種pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥(圖1c)，依次通過(guò)腫瘤微酸響應(yīng)的自靶向激活和腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS響應(yīng)的“藥物突釋和ROS循環(huán)放大”的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)氧化-化療協(xié)同治療并增加療效(圖1d)。

圖1.?(a) VES的化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生ROS機(jī)制；(b) FA和MTX的分子構(gòu)型優(yōu)化和化學(xué)結(jié)構(gòu)；(c) 基于ROS響應(yīng)VES-Se-Se-MTX的自組裝和腫瘤微酸響應(yīng)VES-N=CH-PEG的表面嵌入，構(gòu)建pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥；(d) 腫瘤微酸響應(yīng)的自靶向激活和ROS響應(yīng)的“藥物突釋和ROS循環(huán)放大”應(yīng)用于氧化-化療協(xié)同治療。

II?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的表征

VES-Se-Se-MTX可通過(guò)二硒鍵介導(dǎo)的自組裝形成球狀納米前藥(VSeM)。為進(jìn)一步提高VSeM的分散穩(wěn)定性和延長(zhǎng)其血液循環(huán)時(shí)間，我們利用后插入法在其表面嵌入苯甲酰亞胺鍵連接的VES-N=CH-PEG，構(gòu)建VSeM-N=CH-PEG納米前藥。SEM圖、TEM圖、元素分布圖等表明該納米前藥的大小約為100nm，呈均勻球形分布(圖2a)。依次引入酸性pH和H?O?刺激后，該納米前藥的形貌發(fā)生變化，不僅出現(xiàn)殼結(jié)構(gòu)分離和核結(jié)構(gòu)瓦解(圖1b, c)，而且藥物釋放也得以加快(圖1d)。此外，為研究VSeM-N=CH-PEG納米前藥的ROS產(chǎn)生能力，腫瘤細(xì)胞與VES(小分子)，VES/MTX(小分子混合物)，VCM-N=CH-PEG(ROS不敏感性納米前藥)，VSeM-PEG(pH不敏感性納米前藥)，VSeM-N=CH-PEG(pH/ROS響應(yīng)納米前藥)在pH 6.5條件下共同孵育6 h。結(jié)果表明VSeM-N=CH-PEG相較于VCM-N=CH-PEG和VSeM-PEG，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著更多的ROS(圖2f)。

圖2.?VSeM-N=CH-PEG的理化表征：(a) SEM圖、TEM圖、元素分布圖、激光共聚焦圖；(b) pH 7.4、pH 7.4 + H?O?、pH 6.5、pH 6.4 +?H?O?條件下的TEM圖；(c) pH 7.4和pH 6.5條件下的1H NMR圖；(d) pH 6.5、不同H?O?濃度條件下藥物釋放曲線(xiàn)；(e, f) HeLa細(xì)胞與VES/MTX，VCM-N=CH-PEG，VSeM-PEG，VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5條件下共同孵育6 h后的ROS水平含量分析：(e) 流式曲線(xiàn)圖和(f)?激光共聚焦圖。

III?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的細(xì)胞攝取

為研究納米前藥的細(xì)胞攝取能力，納米前藥與葉酸受體高表達(dá)的HeLa細(xì)胞共孵育4 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤微酸響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5相較于在pH 7.4下，細(xì)胞攝取效率增強(qiáng)約8倍；相較于此，對(duì)腫瘤微酸不敏感的VSeM-PEG在兩種pH下，細(xì)胞攝取效率沒(méi)有顯著性差異(圖3a-d)。結(jié)果表明靶向能力來(lái)源于pH變化下MTX配體的暴露。而且，在pH 6.5下，相較于HeLa細(xì)胞，A549和L02細(xì)胞對(duì)納米前藥的攝取能力顯著降低，歸因于葉酸受體在A549和L02細(xì)胞膜表面上的更低表達(dá)(圖3e)。此外，HeLa細(xì)胞對(duì)VSeM-N=CH-PEG和葉酸靶向的VSeF-N=CH-PEG的攝取能力沒(méi)有明顯區(qū)別(圖3f-g)。這些結(jié)果證實(shí)VSeM-N=CH-PEG納米前藥具備優(yōu)異的腫瘤微酸響應(yīng)的自靶向激活能力。

圖3.?VSeM-N=CH-PEG的腫瘤微酸響應(yīng)的自靶向激活和細(xì)胞攝?。?a) VSeM-N=CH-PEG和VSeM-PEG分別在腫瘤微酸條件下的靶向激活和失活示意圖；(b-d) HeLa細(xì)胞與負(fù)載DiD的VSeM-PEG，VSeM-N=CH-PEG在經(jīng)葉酸有/無(wú)前處理、pH 7.4/6.5條件下共同孵育4 h后的(b)?激光共聚焦圖、(c)?流式曲線(xiàn)圖、(d)?平均熒光強(qiáng)度；(e) L02、A549、HeLa細(xì)胞與負(fù)載DiD的?VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5條件下共同孵育4 h后的激光共聚焦圖；(f-g) HeLa細(xì)胞與負(fù)載DiD的VSe-N=CH-PEG，VSeF-N=CH-PEG，VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5條件下共同孵育4 h后的(f)?激光共聚焦圖、(g)?流式直方圖、(h)?平均熒光強(qiáng)度。

IV?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的體外抗癌活性

為研究納米前藥的細(xì)胞殺傷能力，納米前藥與HeLa細(xì)胞共孵育24 h以測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VSeM-N=CH-PEG(pH/ROS響應(yīng)性)相較于VCM-N=CH-PEG(ROS不敏感性)和VSeM-PEG(pH不敏感性)在pH 6.5條件下對(duì)HeLa和MCF-7兩種腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力(圖4a, b)。此外，在pH 7.4和6.5條件下，VSeM-PEG對(duì)HeLa和MCF-7兩種腫瘤細(xì)胞的殺傷能力沒(méi)有顯著差異；對(duì)比之下，VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5相較于在pH7.5條件下，細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng)(圖4c, d)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)VSeM-N=CH-PEG優(yōu)異的腫瘤微酸響應(yīng)的自靶向激活能力。線(xiàn)粒體去極化(圖4e)和細(xì)胞氧化應(yīng)激(圖4f)顯示VSeM-N=CH-PEG組相較于VCM-N=CH-PEG和VSeM-PEG組而言，細(xì)胞內(nèi)ROS水平含量和capsase-9/caspase-3活性顯著上調(diào)，ATP水平含量顯著下調(diào)。結(jié)果表明VSeM-N=CH-PEG能夠有效阻斷ATP供應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)線(xiàn)粒體功能異常觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡(圖4g)和活死細(xì)胞染色(圖4h)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)VSeM-N=CH-PEG增強(qiáng)性抗腫瘤活性來(lái)源于腫瘤微酸性觸發(fā)自靶向激活、循環(huán)放大的ROS觸發(fā)藥物突釋和線(xiàn)粒體功能異常。

圖4.?VSeM-N=CH-PEG的體外抗腫瘤效果：(a) HeLa和(b) MCF-7細(xì)胞與VES/MTX，VCM-N=CH-PEG，VSeM-PEG，VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5下共孵育24 h后的細(xì)胞存活率；(c) HeLa和(d) MCF-7細(xì)胞與VSeM-PEG和VSeM-N=CH-PEG在pH 7.4和6.5下共孵育24 h后的細(xì)胞存活率；(e-h) HeLa細(xì)胞與VES/MTX，VCM-N=CH-PEG，VSeM-PEG，VSeM-N=CH-PEG在pH 6.5下共孵育12 h后的(e) 線(xiàn)粒體去極化；(f) 細(xì)胞氧化應(yīng)激；(g) 細(xì)胞凋亡；(h) 活死細(xì)胞染色。

V?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的體內(nèi)生物分布和腫瘤蓄積

構(gòu)建HeLa荷瘤裸鼠模型，納米前藥經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后，不同時(shí)間點(diǎn)收集血液測(cè)定血藥濃度，分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明VSeM-PEG和VSeM-N=CH-PEG組相較于VES/MTX和VSeM組，血液循環(huán)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(圖5a)。生物分布實(shí)驗(yàn)表明VSeM-N=CH-PEG組相較于VES/MTX、VSeM、VSeM-PEG組，腫瘤部位的藥物含量顯著更高(圖5b)。活體/離體熒光成像實(shí)驗(yàn)表明相較于負(fù)載DiR的VSeM和VSeM-PEG，負(fù)載DiR的VSeM-N=CH-PEG在腫瘤部位的熒光信號(hào)顯著更強(qiáng)(圖5c, d)，該結(jié)果證實(shí)腫瘤微酸響應(yīng)PEG的表面嵌入能夠顯著提高維生素E納米前藥在腫瘤部位的富集程度。

圖5.?VSeM-N=CH-PEG的藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布、腫瘤蓄積效果：HeLa荷瘤裸鼠靜脈注射VSeM-N=CH-PEG的(a)?藥代動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)和(b)?生物分布效果；HeLa荷瘤裸鼠靜脈注射負(fù)載DiR的VSeM-N=CH-PEG的(c) 0-48 h活體熒光成像圖和(d) 48 h后離體熒光成像圖。

VI?pH/ROS級(jí)聯(lián)響應(yīng)VSeM-N=CH-PEG納米前藥的體內(nèi)抗腫瘤效果

納米前藥經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后，為期14天的抑瘤實(shí)驗(yàn)研究表明VSeM-N=CH-PEG注射組相較于VES/MTX小分子混合物，VCM-N=CH-PEG，VSeM-PEG，VSeM-N=CH-PEG注射組表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的腫瘤增殖抑制能力(圖6a, b)和顯著更高的動(dòng)物生存率(圖6c)。此外，VSeM-N=CH-PEG注射組相較于其他組，腫瘤組織內(nèi)ROS產(chǎn)生能力顯著更高(圖6d)。而且，H&E、TUNEL、Ki-67染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)VSeM-N=CH-PEG的優(yōu)異抗腫瘤結(jié)果(圖6e)，這歸因于VSeM-N=CH-PEG納米前藥中自靶向激活與ROS循環(huán)放大之間的級(jí)聯(lián)集成。

圖6.?VSeM-N=CH-PEG的體內(nèi)抗腫瘤效果：(a)?腫瘤體積變化曲線(xiàn)；(b) 治療結(jié)束第14天腫瘤體重和腫瘤照片；(c) 動(dòng)物生存率；(d) 腫瘤切片的細(xì)胞內(nèi)ROS水平；(e) 腫瘤切片的H&E、TUNEL、Ki-67染色圖。

作者簡(jiǎn)介

劉小龍?研究員

本文通訊作者

中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所&

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院

▍主要研究領(lǐng)域

從事腫瘤早期診斷新技術(shù)與新方法、免疫治療與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面的基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究。

▍主要研究成果

主持國(guó)家自然科學(xué)基金“重大科研儀器研制項(xiàng)目”、重點(diǎn)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目、國(guó)家傳染病防治科技重大專(zhuān)項(xiàng)等科研項(xiàng)目；以通訊作者在Advanced Science, ACS Nano, Clinical Cancer Research, Nature Communications, Small等雜志發(fā)表論文90多篇；入選福建省百人計(jì)劃、福建省衛(wèi)生健康突出貢獻(xiàn)中青年專(zhuān)家，榮獲2015年日本腫瘤學(xué)會(huì)青年科學(xué)家獎(jiǎng)、2019年福建省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎(jiǎng)。

▍Email:?xiaoloong.liu@gmail.com

劉景豐?研究員

本文通訊作者

中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所&

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院

▍主要研究領(lǐng)域

從事肝膽外科、肝移植及肝癌綜合治療的相關(guān)臨床及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究工作。

▍主要研究成果

主持完成國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家傳染病防治科技重大專(zhuān)項(xiàng)及省部級(jí)科研項(xiàng)目20多項(xiàng)；以通訊作者在Lancet Gastroenterology & Hepatology, Journal of Clinical Oncology, Cell Research, Advanced Science, ACS Nano, Clinical Cancer Research, Small等雜志發(fā)表論文100多篇；入選新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程國(guó)家級(jí)人選、國(guó)務(wù)院政府特殊津貼、福建省勞動(dòng)模范、福建省科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才、國(guó)家衛(wèi)健委突出貢獻(xiàn)中青年專(zhuān)家。榮獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和福建省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。

▍Email:?drjingfeng@126.com

撰稿：原文作者

編輯：《納微快報(bào)》編輯

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