2022年2月，北京大學(xué)人民醫(yī)院王俊院士團(tuán)隊在?Clinical and Translational Medicine?發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals the multi-cellular ecosystem indifferent radiological components of pulmonary part-solid nodules”的研究成果。通過比較肺腺癌早期患者部分實性結(jié)節(jié)的兩個區(qū)域（磨玻璃樣和實性部分）和正常肺組織，發(fā)現(xiàn)磨玻璃樣成分的細(xì)胞景觀更類似于實性部分。深入分析發(fā)現(xiàn)二者除免疫微環(huán)境存在輕微差別外，周細(xì)胞在兩種不同放射學(xué)成分中也具有獨(dú)特作用。該研究中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Clinical and Translational Medicine

【發(fā)布時間】2022年2月

【影響因子】11.492

【檢測技術(shù)】10x Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究背景

隨著胸部 CT 掃描的廣泛應(yīng)用，影像學(xué)上伴有亞實性結(jié)節(jié)（SSN）的早期肺腺癌（LUAD）的檢出率顯著提高。與實性結(jié)節(jié)相比，SSNs 具有惰性生長模式和良好的預(yù)后。根據(jù)薄層 CT 掃描特征可進(jìn)一步將 SSNs 分為單純磨玻璃（GG）結(jié)節(jié)和部分實性（PSNs）結(jié)節(jié)。前期研究表明 SSNs 的生態(tài)系統(tǒng)介于正常肺組織和實體肺腺癌之間，然而基于放射學(xué)區(qū)分的部分實性結(jié)節(jié)中的2個部分中，磨玻璃樣成分的微環(huán)境與正常組織還是侵襲性成分更相似，微環(huán)境變化是否由磨玻璃成分向?qū)嵭圆糠种饾u轉(zhuǎn)化尚不知曉。

研究路線

研究結(jié)果

1、構(gòu)建部分實性肺結(jié)節(jié)及正常肺組織單細(xì)胞圖譜

為了解部分實性肺結(jié)節(jié)（PSNs）中磨玻璃樣（GG）、實性部分與正常肺組織的區(qū)別，研究人員對來自12名未經(jīng)治療部分實性肺結(jié)節(jié)患者的磨玻璃樣部分和實性部分組織樣本以及5個非肺癌區(qū)域的正常對照組織，利用 10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行檢測，分析獲得9種主要的細(xì)胞類型，包括 T 細(xì)胞、髓系細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、B 細(xì)胞、血漿和黏膜相關(guān)淋巴組織 B 細(xì)胞（MALT?B）、肥大細(xì)胞、成纖維和周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞（肺泡細(xì)胞和癌細(xì)胞）。

通過比較三組間的免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞和 NK 細(xì)胞在對照樣本中富集，并且其占比從健康樣本向?qū)嵭圆糠种鸩綔p少。此外，從 GG 到實性部分 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、血漿和 MALT B 細(xì)胞的占比趨于增加，這些細(xì)胞在病變組織中的占比顯著高于正常肺組織，暗示亞實性肺結(jié)節(jié)（SSNs）中適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活。通過免疫組化，研究人員也證實了 GG 和實性部分組織中免疫細(xì)胞類型的細(xì)微變化。

2、磨玻璃樣及實性部分間腫瘤內(nèi)異質(zhì)性分析

接下來，研究人員對主要細(xì)胞類型表達(dá)譜特征進(jìn)行分析。在上皮細(xì)胞中有種亞型，包括I型肺泡細(xì)胞（AT1）、II型肺泡細(xì)胞（AT2）、基底呼吸道上皮細(xì)胞和纖毛呼吸道上皮細(xì)胞，而其中能夠誘發(fā)肺腺癌的 AT1 和 AT2 細(xì)胞最為豐富。為區(qū)分腫瘤組織中上皮細(xì)胞的惡性程度，研究人員分析了上皮細(xì)胞中的拷貝數(shù)變異（CNV）水平，發(fā)現(xiàn)同一個體來源的 GG 和實性樣本具有相同的 CNV 模式，說明基因組特征與放射學(xué)影像特征不存在關(guān)聯(lián)性，細(xì)胞降維分群結(jié)果則表明在不同患者來源的腫瘤在轉(zhuǎn)錄組水平具有明顯的異質(zhì)性。此外，GG 和實性樣本在所有上皮細(xì)胞中具有相似比例的惡性細(xì)胞，表明不同的放射學(xué)影像表現(xiàn)并不是由細(xì)胞從正常轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒缘某潭葲Q定的。
為了解 GG 和實性組織中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征及二者之間的差異，研究人員利用非負(fù)矩陣分解（NMF）的方法解析每個樣本的腫瘤異質(zhì)性。分析發(fā)現(xiàn)在 GG 和實性組織中存在7個相同的功能模塊，涉及翻譯起始、免疫激活、基于微管的運(yùn)動、RNA 剪接、胞外基質(zhì)重塑/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、應(yīng)激反應(yīng)和體內(nèi)平衡。而與 GG 中的腫瘤細(xì)胞相比，實性部分的腫瘤細(xì)胞中血管生成、EMT、KRAS 和 p53 信號傳導(dǎo)及細(xì)胞周期相關(guān)通路顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明 SSNs 中兩種放射學(xué)分型來源的惡性細(xì)胞具有不同的功能模式，可能導(dǎo)致二者增殖和侵襲性的差異。

3、亞實性肺結(jié)節(jié)實性部分 T/NK 細(xì)胞毒性作用受到抑制

對 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)分群，比較分析發(fā)現(xiàn) GG 和實性部分 CD4+?T 細(xì)胞占比相當(dāng)，但顯著高于對照樣本。效應(yīng) CD4+?T 細(xì)胞和效應(yīng)記憶性 T 細(xì)胞是腫瘤樣本中的重要細(xì)胞群，特征是高表達(dá)細(xì)胞因子?IL2，二者均表現(xiàn)出抗腫瘤功能。此外，耗竭的 CD4+?T 細(xì)胞高表達(dá)濾泡輔助性 T 細(xì)胞的 marker 基因?CXCL13?和?BTLA，并在腫瘤樣本中富集。對 CD8+?T 細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，雖然各亞群在3組樣本中占比相近，但細(xì)胞毒性打分結(jié)果顯示與 GG 組相比，實性組細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能減弱。
相較于腫瘤樣本，NK 細(xì)胞在正常肺組織中顯著富集，并且高表達(dá)細(xì)胞毒性相關(guān) marker，如 PRF1、NKG7 和 GNLY。細(xì)胞毒性打分顯示，高表達(dá) CD16 的 NK 細(xì)胞具有最強(qiáng)的細(xì)胞毒性，并且 CD16highGZMBhighNK 細(xì)胞從正常組織到 GG 和實性部分逐漸減少?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測 NK 細(xì)胞的免疫應(yīng)答在實性部分受到抑制，這可能會促進(jìn)亞實性結(jié)節(jié)中其他侵襲性區(qū)域的免疫逃逸。

4、磨玻璃樣和實性部分腫瘤中髓系細(xì)胞分析

巨噬細(xì)胞細(xì)分為4個亞群，其中 IL1Bhigh?肺泡駐留巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促炎的 M1 型巨噬細(xì)胞特征，相對高表達(dá) IL1B、IL1A、腫瘤壞死因子（TNF）和 CXCL10-11，而另一亞群——血管周駐留巨噬細(xì)胞則表主要現(xiàn)出抗炎的 M2 型巨噬細(xì)胞特征。此外，血管周駐留巨噬細(xì)胞群還高表達(dá)血管生成相關(guān)基因，如 VEGFA 和 CXCL8，并且在腫瘤組織中更為富集。分析還發(fā)現(xiàn)，實性部分腫瘤中 M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)要低于 GG 腫瘤，暗示兩種放射學(xué)分型的腫瘤中巨噬細(xì)胞具有不同的炎癥程度。
DC 細(xì)胞分析得到3個亞群，分別為單核細(xì)胞衍生的 DC 細(xì)胞、遷移性 DC 細(xì)胞和2型 DC 細(xì)胞，三個亞群均在腫瘤樣本中顯著富集。對中性粒細(xì)胞的分析得到2個亞群，分別是 IL1Bhigh和 LI1Blow?亞型，他們在所有髓系細(xì)胞中顯示出最強(qiáng)的急性炎癥功能。中性粒細(xì)胞是人體先天免疫的第一道防線，可以通過釋放大量具有生物活性的 IL-1β 以調(diào)節(jié)炎癥消退。通過分析發(fā)現(xiàn)正常肺組織中中性粒細(xì)胞占比高于亞實性肺結(jié)節(jié)的任何一個組成部分，表明適應(yīng)性免疫反應(yīng)在腫瘤中被激活。

5、磨玻璃樣和實性部分腫瘤中基質(zhì)細(xì)胞功能分析

對內(nèi)皮細(xì)胞重降維得到6個亞群，其中 INSR 是腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的 marker 基因，其功能涉及血管生成，并且 INSR+?腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤組織中更為富集，說明腫瘤微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞亞型存在重塑。另一 ACKR1+?腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞亞群在實性部分占位中顯著富集。ACKR1 在腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，這說明實性部分腫瘤中炎癥反應(yīng)上調(diào)。
通過對3組樣本中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行受體-配體分析發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞在肺癌的細(xì)胞間相互作用中起著至關(guān)重要的作用。實性腫瘤中，內(nèi)皮細(xì)胞通過 CCL14-CCR1 信號招募 CD4+?T 細(xì)胞、CD8+?T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而在亞實性結(jié)節(jié)中觀察到更為富集的內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞間 VEGF-VEGFR 信號傳導(dǎo)。有趣的是，在實性部分腫瘤中發(fā)現(xiàn)了更多的從周細(xì)胞到內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，推測周細(xì)胞在不同放射學(xué)腫瘤分型中有著獨(dú)特的作用。

研究結(jié)論

本研究通過分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，全面剖析了磨玻璃和部分實性結(jié)節(jié)的實性部分中細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)。分析發(fā)現(xiàn)在實性部分的惡性細(xì)胞中血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、KRAS、p53 和細(xì)胞周期信號通路顯著上調(diào)。對于腫瘤微環(huán)境，實性部分中髓系細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的相對豐度往往高于磨玻璃區(qū)域，二者之間存在輕微的細(xì)胞亞型組成差異。另外，T/NK 細(xì)胞亞群的細(xì)胞毒功能和巨噬細(xì)胞的促炎功能在實性部分中受到抑制。

參考文獻(xiàn)：

Li Yanmeng, Li Xiao, Chen Haiming et al. Single-cell RNA sequencing reveals the multi-cellular ecosystem in different radiological components of pulmonary part-solid nodules.?Clin Transl Med, 2022, 12: e723.