2022年2月山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張曉魯研究團(tuán)隊(duì)在?Cell Mol Gastroenterol Hepatol?（IF=9.225）發(fā)表文章，第一作者為山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝膽外科李洪光教授，該研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序剖析了人類(lèi)遠(yuǎn)端膽管癌（dCCA）的異質(zhì)性景觀和腫瘤微環(huán)境（TME）組成。旨在揭示遠(yuǎn)端膽管癌腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性。該研究中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Cell Mol Gastroenterol?Hepatol

【發(fā)布時(shí)間】2022年2月

【影響因子】9.225

【關(guān)鍵詞】單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，遠(yuǎn)端膽管癌

研究背景

遠(yuǎn)端膽管癌（dCCA）是一種發(fā)生在遠(yuǎn)端膽總管的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，約占所有膽管癌病例的40%。dCCA 是一種高度致命的疾病，通常具有顯著的細(xì)胞異質(zhì)性。全面探索細(xì)胞多樣性和腫瘤微環(huán)境（TME）對(duì)于描述驅(qū)動(dòng) dCCA 進(jìn)展的機(jī)制至關(guān)重要。

研究思路

研究結(jié)果

1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示人類(lèi) dCCA 細(xì)胞圖譜

構(gòu)建了 4 名 dCCA 患者的 4 份 dCCA 樣本和 3 份匹配的相鄰正常膽管組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（圖 1，A）。共 30,860 個(gè)細(xì)胞進(jìn)一步注釋為 11 種不同細(xì)胞類(lèi)型，包括 T 細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B 細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肥大細(xì)胞和組織干細(xì)胞（圖 1，B 和 C）。熱圖展示了每種細(xì)胞類(lèi)型的 top 3 的差異基因（DEG）（圖 1，D）。條形圖顯示了每個(gè)樣本中細(xì)胞類(lèi)型的比例以及每種細(xì)胞類(lèi)型中每個(gè)樣本的比例（圖 1，E 和 F）。

進(jìn)一步量化響應(yīng) dCCA 惡性腫瘤的細(xì)胞類(lèi)型豐度的變化，確定了跨越 KNN 圖的 2446 個(gè)鄰接，其中 77 個(gè)顯示了正常（N）和惡性（M）條件之間豐度差異的證據(jù)（圖 2，B）。將差異豐度結(jié)果與之前確定的所有細(xì)胞群進(jìn)行比較，恢復(fù)了除肥大細(xì)胞群外的所有細(xì)胞群中差異豐度的鄰接（圖 2，C）。?

2、惡性細(xì)胞亞群在人類(lèi) dCCA 中表現(xiàn)出腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

所有上皮細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為 6 個(gè)主要亞群（圖 3，A），包括 1 個(gè)正常上皮細(xì)胞亞群（N）和 5 個(gè)惡性亞群（M1-M5），顯示出不同程度的 CNV 評(píng)分（圖 3，B 和 C）。亞群 M1 是最主要的惡性亞群，而 M5 數(shù)量最少（圖 3，D）。5 種惡性亞型表現(xiàn)出很大程度的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖 3，A）。每種惡性亞型都顯示了特異表達(dá)的 DEG（圖 3，E 和 F）。惡性組織中有 212 個(gè)上調(diào)基因，正常組織中有 70 個(gè)相對(duì)高表達(dá)的基因（圖 3，G）。KEGG 功能富集分析表明，在惡性腫瘤中高表達(dá)的基因主要富集于細(xì)胞連接、ErbB 和 Notch 等信號(hào)通路（圖 3，H）。

通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）和 qPCR 方法驗(yàn)證每個(gè)亞群的 marker 基因表達(dá)，并顯示了每個(gè)樣本的形態(tài)學(xué)特征（圖 4）。結(jié)果與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，尤其是在蛋白質(zhì)水平上。

接下來(lái)，采用 SCENIC 方法分析所有惡性上皮細(xì)胞亞群并識(shí)別不同信號(hào)性質(zhì)的潛在轉(zhuǎn)錄因子（TF）（圖 5，A）。發(fā)現(xiàn)了所有惡性亞群的共同潛在 TF，例如 STAT3 和 Rel（圖 5，B），SMARCC2、EGR1、IKZF1、STAT1 和 POU2F3 分別為 M1 到 M5 中具有代表性的基礎(chǔ) TF（圖 5，A 和 B）。所有上皮細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡圖顯示，正常上皮細(xì)胞和每個(gè)惡性細(xì)胞亞群形成一個(gè)連續(xù)體，但惡性亞群彼此分離，具有不同的表達(dá)特征，證實(shí)了人 dCCA 中惡性亞克隆的異質(zhì)性（圖 5，C）。正常的上皮細(xì)胞群形成了一個(gè)根，有 2 個(gè)主要的軌跡分支，將 M1 與 M2、M3 和 M5 分開(kāi)（圖 5，D）?；蚣儺惙治觯℅SEA）表明所有 M 子集共享一些共同的激活特征，M1 和 M2 亞組共享最常見(jiàn)的途徑（圖 5，E）。

3、惡性細(xì)胞表現(xiàn)出與 17 號(hào)染色體相反的改變狀態(tài)

有趣的是，低和高 CNV 的 M 亞組特征分別是 chr17q12 - chr17q21.2 的擴(kuò)增或缺失（圖 3，C）。該區(qū)域涉及多個(gè)顯著的腫瘤相關(guān)基因，所有這些基因在 M1 中均高表達(dá)，而與 N 組相比，它們?cè)?M2 至 M5 中的表達(dá)水平相對(duì)較低（圖 5，F(xiàn)）。偽時(shí)間軌跡表達(dá)也顯示了這些基因在亞組之間差異的表達(dá)分布（圖 5，G）。并且與 CCA 患者的患者總生存概率密切相關(guān)（圖 5，H）。

4、人 dCCA 腫瘤中富含細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞和免疫抑制性腫瘤浸潤(rùn)性 Treg

在非癌性膽道組織中，僅檢測(cè)到 Na?ve CD4+ 和 Na?ve CD8+ T 細(xì)胞（圖 6，A），而在癌組織中，鑒定出 4 個(gè)不同的 T 細(xì)胞亞群（圖 6，B）。Na?ve T 細(xì)胞在腫瘤和非腫瘤組織中均占主導(dǎo)地位，細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞是 dCCA 中的主要效應(yīng)子（圖 6，C 和 D）。接下來(lái)，使用 iTALK 研究正常組織或腫瘤組織中 T 細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，ERBB2 受體在腫瘤組織中增強(qiáng)，表明阻斷 ERBB2 信號(hào)傳導(dǎo)可能會(huì)影響惡性細(xì)胞的增殖作用（圖 6，E）。

5、dCCA 和 iCCA 的單細(xì)胞數(shù)據(jù)比較

與已發(fā)表的肝內(nèi)膽管癌（iCCA）單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，證實(shí)了 iCCA 和 dCCA 之間不同的表達(dá)變化情況（圖 7，C）?？偣矙z測(cè)到 45 個(gè)基因在 iCCA 中顯著上調(diào)，而 17 個(gè)基因在 dCCA 中過(guò)表達(dá)（圖 7，D）。GSEA分析表明，二者富集了不同的激活信號(hào)通路（圖 7，E）。

總結(jié)

本研究全面繪制了人類(lèi) dCCA 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀，揭示了高水平的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性以及對(duì) dCCA 具有潛在臨床意義的關(guān)鍵生物學(xué)特征。

參考文獻(xiàn)

Li H, Qu L, Yang Y, Zhang H, Li X, Zhang X. Single-cell transcriptomic architecture unraveling the complexity of tumor heterogeneity in distal cholangiocarcinoma [published online ahead of print, 2022 Feb 24].?Cell Mol Gastroenterol Hepatol.?2022; S2352-345X（22）00041-8.doi:10.1016/j.jcmgh.2022.02.014