三年前的一個冬季，「新型冠狀病毒肺炎」這個名詞深深印在了我們腦海里，再也揮之不去，三年后的這個冬季，我們迎來了全面放開，但新冠病毒依舊沒有離開?；仡欉@三年，不難發(fā)現(xiàn)每到冬天新冠就會越發(fā)猖狂。新冠病毒“看季節(jié)下菜碟”這一點，與流感病毒可以說如出一轍，但這究竟是為什么呢？

近日，馬薩諸塞州眼耳醫(yī)院和波士頓東北大學(xué)的研究人員于 《Journal of Allergy and Clinical Immunology》發(fā)表了題為“Cold exposure impairs extracellular vesicle swarm–mediated nasal antiviral immunity”的研究論文，這項研究對該現(xiàn)象做出了科學(xué)解釋——冷暴露會削弱鼻腔上皮TLR3依賴性EV分泌和miR-17豐度，從而抑制抗病毒活性，此外還會降低了EV表面受體蛋白的TLR3依賴性上調(diào)，并削弱表面受體與病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性。

首先，作者確定了TLR3刺激是否影響鼻上皮EV分泌。Poly（I:C）是典型的TLR3激動劑，作者在原代人鼻上皮細胞（HNEpCs）中進行了一次實驗，發(fā)現(xiàn)用Poly（I:C）刺激后5小時后開始促進EV分泌，在24小時觀察到峰值釋放效果，且Poly（I:C）以時間和劑量依賴的方式刺激鼻上皮EV分泌。作者接下來驗證了這種效應(yīng)是通過激活TLR3-IRF3信號軸介導(dǎo)的。在Poly（I:C）存在下，用TLR3/dsRNA復(fù)合物抑制劑預(yù)處理細胞可下調(diào)TLR3和磷酸化IRF3的蛋白表達，并對Poly（I:C）刺激的EV分泌效應(yīng)產(chǎn)生負面影響。分泌型EV的總數(shù)與未刺激的對照組相當(dāng)。然而，當(dāng)用TLR3/dsRNA復(fù)合物抑制劑和IRF3激動劑KIN1148的混合物預(yù)處理細胞時，TLR3-IRF3信號軸的阻斷和與TLR3的競爭性結(jié)合誘導(dǎo)的EV分泌的減少被完全消除。以上證明了TLR3刺激誘導(dǎo)鼻上皮EV分泌。

圖1 TLR3刺激誘導(dǎo)鼻上皮EV分泌

作者先用3種不同的常見呼吸道病毒（包括冠狀病毒CoV_OC43、次要組鼻病毒RV-1B和主要組鼻病毒RV-16）作為上呼吸道病原體，在原發(fā)性HNEpCs中建立了感染模型。接下來使用培養(yǎng)模型評估TLR3刺激的EV介導(dǎo)的體外抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)與感染相同病毒滴度的未處理細胞相比，暴露于TLR3刺激的EV導(dǎo)致細胞內(nèi)病毒mRNA水平顯著降低，表明病毒復(fù)制受到抑制。此外，TLR3刺激的EV以劑量依賴的方式阻斷病毒感染，即使是在2.5 × 109/mL的最低濃度下也分別導(dǎo)致38.37%、72.59%和61.51%的CoV_OC43、RV-1B和RV-16的復(fù)制抑制。

圖2 TLR3刺激的EVs對呼吸道病毒表現(xiàn)出強大的抗病毒活性

接著，作者探討了潛在的抗病毒機制。分層聚類分析顯示，單個TLR3刺激的EV樣品的miRNA表達水平彼此之間非常相關(guān)，并且與對照EV樣品不同。在確認(rèn)有TLR3刺激和無TLR3刺激的EVs的差異miRNA譜后，通過火山圖分析數(shù)據(jù)，找出了TLR3刺激后顯著上調(diào)且與抗病毒作用相關(guān)的6種miRNA。在這些miRNA中，miR-17先前被報道在URI期間抑制病毒復(fù)制，作者選擇它作為作用靶機制進行了驗證。將合成miR-17模擬物轉(zhuǎn)染到原代HNEpCs中，miR-17模擬物的轉(zhuǎn)染抑制了病毒RNA復(fù)制，顯著降低了宿主細胞中CoV_OC43、RV-1B和RV-16mRNA水平。二次驗證，作者使用mirV和miR-17抑制劑在TLR3刺激的EV中實現(xiàn)miR-17的特異性敲除。受體感染細胞中CoV_OC43、RV-1B和RV-16mRNA水平顯著高于TLR3刺激的非靶向陰性對照EV，表明TLR3刺激誘導(dǎo)的EVs中miR-17的豐度賦予增強的抗病毒活性。

圖3 TLR3刺激上調(diào)EVs中的miR-17，從而增強抗病毒活性

作者發(fā)現(xiàn)，與未受刺激的對照相比，TLR3刺激在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上顯著上調(diào)了EVs中的LDLR和ICAM-1，這表明TLR3刺激促進了EVs內(nèi)表面受體蛋白的包裝。接下來研究了表面受體蛋白的富集是否與TLR3依賴性EVs介導(dǎo)的內(nèi)在抗病毒活性相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，TLR3刺激的EV在暴露于受體宿主細胞之前在37℃下與病毒預(yù)培養(yǎng)1小時，對RV-1B和RV-16表現(xiàn)出更強的抗病毒效果。這表明TLR3刺激的EV表面受體蛋白-病毒相互作用可以通過充當(dāng)誘餌來抑制病毒感染，從而防止病毒與其宿主細胞中的細胞受體結(jié)合。

圖4 TLR3刺激的EV表面受體-病毒相互作用有助于抗病毒活性并防止病毒進入宿主細胞

作者設(shè)置了5℃的溫度降低，在活體人鼻甲粘膜組織中進行實驗，發(fā)現(xiàn)TLR3刺激在37℃時導(dǎo)致EV分泌顯著增加，而32℃的低溫顯著損害TLR3依賴性EV分泌。接下來進行了冷暴露對TLR3刺激的EV介導(dǎo)的抗病毒活性的影響研究。作者分析了兩種溫度下TLR3刺激的EV的組成，與未受刺激的對照組相比，在37℃時TLR3刺激顯著增加了EVs中miR-17的表達。在32℃的低溫下孵育顯著降低了TLR3依賴性miR-17的上調(diào)。表明通過TLR3信號刺激的EV分泌和抗病毒miRNA包裝的增強取決于環(huán)境溫度，在32℃時產(chǎn)生的TLR3刺激的EV的抗病毒活性降低與冷暴露誘導(dǎo)的miR-17的TLR3依賴性豐度受損密切相關(guān)。

圖5 冷暴露會削弱TLR3依賴性EV分泌和miR-17豐度，從而抑制抗病毒活性

同樣，作者繼續(xù)使用上述實驗方法發(fā)現(xiàn)與未受刺激的對照組相比，在37℃溫度下TLR3刺激時，EVs中LDLR的基因和蛋白表達顯著增加，而當(dāng)EVs在32℃溫度下孵育時，LDLR蛋白的TLR3依賴性上調(diào)顯著受損。表明，冷暴露降低了EV表面受體蛋白的TLR3依賴性上調(diào)。此外，TLR3刺激EV表面受體-病毒相互作用有助于抗病毒活性并阻止病毒進入宿主細胞，作者還發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度降低會影響這種作用，削弱了表面受體與病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性。

圖6 冷暴露降低了EV表面受體蛋白的TLR3依賴性上調(diào)，并削弱了表面受體與病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性

綜上所述，EV參與TLR3依賴性抗病毒免疫，通過EV介導(dǎo)的miR-17功能傳遞和通過表面受體（包括LDLR和ICAM-1）與病毒配體結(jié)合后的直接病毒粒子中和，保護宿主免受病毒感染。這些由TLR3刺激的EV介導(dǎo)的有效抗病毒免疫防御功能因冷暴露而受損，其途徑是EV總分泌減少以及單個EV的microRNA包裝和抗病毒結(jié)合親和力降低，此外，冷暴露還降低了EV表面受體蛋白的TLR3依賴性上調(diào)，并削弱了表面受體與病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性。此研究為上呼吸道感染流行性疾病、新冠肺炎的季節(jié)性變化、在冬季傳染性增強做出解釋。

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091674922014233