上期為大家介紹了螢光素酶的發(fā)展和原理。螢光素酶作為一種理想的報告基因，常用于研究miRNA與靶基因的靶向互作、轉(zhuǎn)錄因子和啟動子調(diào)控機制等。本期就來詳細聊聊雙螢光素酶在miRNA與靶基因靶向互作方面的應用。

MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，一個miRNA可以靶向幾個不同基因進行調(diào)節(jié)，同時幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。miRNA可以與編碼基因mRNA的3’UTR結(jié)合來抑制mRNA的表達，也可以直接與circRNA或lncRNA結(jié)合來調(diào)控相關(guān)基因的表達。

miRNA通常是通過其種子區(qū)（seed region），即5’端2-8位堿基與目的RNA靶位點完全匹配結(jié)合（注：RNA之間存在U-G結(jié)合的模式），并在沉默復合體（miRNA-induced silencing complex）的共同作用下導致目的RNA降解，進而致使目的RNA的表達量下調(diào)?；谶@個原理，miRNA-target 雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)被科研工作者普遍認可，用于驗證miRNA與靶基因的直接靶向關(guān)系。

漢恒生物所使用的螢光素酶報告基因載體psi-CHECK2采用了螢火蟲/海腎雙螢光素酶雙報告基因系統(tǒng)，其中海腎螢光素酶為檢測報告基因，而螢火蟲螢光素酶則作為內(nèi)參報告基因。驗證miRNA與mRNA/lncRNA/circRNA的互作，將要研究的靶點序列（序列可以是mRNA的3’UTR，也可以是lncRNA/circRNA序列）插入到報告載體中，作為海腎雙螢光素酶的3’UTR，與miRNA的mimics共同轉(zhuǎn)染細胞，最后使用酶標儀檢測。

圖1 pisCHECK2結(jié)構(gòu)圖

圖2 miRNA與靶基因互作雙螢光素酶系統(tǒng)原理示意圖

步驟詳解

數(shù)字列表結(jié)合位點預測

使用Targetscan、Starbase等網(wǎng)站預測結(jié)合位點。

合成miRNA mimics

使用Mirbase網(wǎng)站查詢獲得miRNA成熟體序列，合成miRNA mimics。

擴增目的片段

載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染組別設置

第1、2組可說明miRNA與靶基因是否存在結(jié)合，第3、4組則可說明突變序列是否是miRNA與靶基因的結(jié)合位點。每組設置3個平行。同時設置空白對照，即不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和miRNA mimics，只有細胞樣本和轉(zhuǎn)染試劑的空白組。

注：若預測出多個結(jié)合位點且需要明確具體是哪個結(jié)合位點發(fā)揮作用，則要將多個結(jié)合位點分別突變，構(gòu)建突變型重組表達載體psiCHECK2-mut1、psiCHECK2-mut2、psiCHECK2-mut3……以此類推，分別與miRNA NC、miRNA mimics轉(zhuǎn)染細胞進行雙螢光素酶驗證實驗。我們以三個突變質(zhì)粒來設置分組如下：

（1）去除背景值：使用酶標儀檢測空白組作為blank組，可能會檢測出極低的數(shù)值，該數(shù)值為背景值，需要去除。

（2）數(shù)據(jù)歸一化：將同一樣品的去除背景值后的海腎螢光素酶數(shù)值（R）除以去除背景后的螢火蟲螢光素酶數(shù)值（F）。

（3）數(shù)據(jù)分析：歸一化的數(shù)據(jù)取平均值作圖。相比攜帶野生型質(zhì)粒和miRNA NC的陰性對照組，攜帶野生型質(zhì)粒和miRNA mimic的實驗組的相對螢光素酶活性顯著下降，即R/F比值減小，而攜帶突變型質(zhì)粒的兩組實驗組相對螢光素酶活性無顯著變化。

案例分析

重慶醫(yī)科大學廖正步教授發(fā)現(xiàn)損傷腦組織中circIgfbp2顯著升高，敲低circIgfbp2可減輕TBI（創(chuàng)傷性腦損傷）小鼠的焦慮和睡眠障礙。先前有研究表明hsa-miR-370-3p與抑郁癥相關(guān)，通過生信分析得出circIgfbp2與hsa-miR-370-3p有3個潛在的結(jié)合位點。因此，作者將circIgfbp2野生型和突變型構(gòu)建到psiCHECK2載體上，與hsa-miR-370-3p mimics 共轉(zhuǎn)染HT22細胞進行雙螢光素酶驗證，結(jié)果顯示circIgfbp2可與hsa-miR-370-3p結(jié)合。最終作者證明circIgfbp2通過吸附hsa-miR-370-3p調(diào)控BACH1導致線粒體功能障礙和突觸功能障礙，表示circIgfbp2可能成為治療TBI后焦慮和睡眠障礙的新靶點。

圖1.circIgfbp2與hsa-miR-370-3p雙螢光素酶驗證實驗結(jié)果

山西醫(yī)科大學宋靜教授構(gòu)建了煤塵顆粒致大鼠肺纖維化模型，提取外泌體鑒定出4個差異表達的miRNA，miRNA-21p-5p為其中之一，利用生信分析得出Smad7是miRNA-21p-5p的潛在靶基因，接著使用雙螢光素酶實驗驗證，結(jié)果顯示兩者存在互作，因此作者推測miRNA 21-5p /Smad7可能參與了煤塵顆粒誘導的肺纖維化，為煤工塵field的發(fā)病機制提供了新的思路。

圖2.Smad7與miRNA-21p-5p雙螢光素酶驗證實驗結(jié)果

本期主要介紹了miRNA與靶基因互作研究的原理、實驗操作，并附上了兩篇案例文獻，希望對從事相關(guān)研究的小伙伴有所幫助。下期我們將介紹雙螢光素酶系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄因子和啟動子調(diào)控機制方面的應用，感興趣的小伙伴可以留意一下哦~

參考文獻

[1] Mengran D,Chenrui W,Renqiang Y, et al. A novel circular RNA, circIgfbp2, links neural plasticity and anxiety through targeting mitochondrial dysfunction and oxidative stress-induced synapse dysfunction after traumatic brain injury.[J]. Molecular psychiatry,2022,27(11).

[2] Jing S,Mengtong X,Tiantian W, et al. Exosomal miRNAs contribute to coal dust particle-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2023,249.