引言：

水凝膠是一類重要的軟性材料，被廣泛應(yīng)用于藥物研究、藥物遞送、組織工程和食品科學(xué)等領(lǐng)域。在眾多制備水凝膠的天然高分材料中，海藻酸鹽作為一種天然多糖，由于其低毒性、溫和的離子交聯(lián)條件、良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到極大的關(guān)注[1]。

目前，現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了微米大小的海藻酸鹽凝膠珠作為3D細(xì)胞培養(yǎng)的生物支架模擬細(xì)胞生長的基質(zhì)環(huán)境，被廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞的封裝、培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)[2]。Uyen N.T.T.等人發(fā)現(xiàn)微米級(jí)的海藻酸鹽凝膠微球既可以控制藥物的釋放速度，又能將藥物遞送到特定的治療靶點(diǎn)，且藥物釋放后的海藻酸鹽可直接被降解通過代謝排出體內(nèi)[3]。通常情況下，海藻酸鹽水溶液在封裝過程中與Ca2+、Ba2+、Cu2+、Cd2+和Sr2+等二價(jià)陽離子進(jìn)行離子交聯(lián)以制備海藻酸鹽凝膠。如將海藻酸鈉滴入過量的氯化鈣水溶液中，并通過攪拌或超聲制備海藻酸鹽微凝膠珠[4]。然而，這種方法生產(chǎn)的微凝膠存在粒徑單分散性差和形狀不規(guī)則等缺點(diǎn)。因此，生產(chǎn)單分散性良好和結(jié)構(gòu)均勻的凝膠珠仍存在不少問題。

采用液滴微流控技術(shù)可以生產(chǎn)形狀精確可控和粒徑均一的海藻酸鹽凝膠。通常，海藻酸鈉溶液在液滴微流控芯片中乳化并分散在油相中，并與Ca2+進(jìn)行交聯(lián)。而這種快速的交聯(lián)反應(yīng)可能導(dǎo)致液滴生成粒徑不均和微流控芯片的堵塞。因此，采用液滴微流控制備時(shí)需將液滴生成與凝膠化反應(yīng)分開。現(xiàn)有技術(shù)中公開了通過將CaCO3納米顆粒分散于海藻酸鹽水溶液中，然后將生成后的液滴暴露在酸性條件下，導(dǎo)致CaCO3的溶解釋放Ca2+，并使其與海藻酸鹽交聯(lián)凝膠化[5]。然而，由于CaCO3呈顆粒狀，pH降低導(dǎo)致Ca2+的釋放分布不均，進(jìn)而使得離子交聯(lián)均勻性較差。此外，納米顆粒的團(tuán)聚也會(huì)導(dǎo)致微流控芯片流道的堵塞。

為此，Utech等通過用螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)螯合Ca2+形成Ca-EDTA，使其穩(wěn)定的分散在海藻酸鹽溶液中。然后，將經(jīng)微流控芯片制備微液滴的油水混合物通入酸性的油相中，Ca2+由H+與EDTA的結(jié)合而被釋放，并與海藻酸鹽交聯(lián)形成凝膠珠[6]。雖然這種方法可以制備結(jié)構(gòu)均勻的離子交聯(lián)海藻酸鹽凝膠珠，但該工藝凝膠固化所需的pH(pH<5)較低。這很有可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的存活，不利于細(xì)胞和組織生長。

基于以上存在的問題，F(xiàn)luidicLab微滴制備平臺(tái)通過借助配體與離子結(jié)合能力的不同，實(shí)現(xiàn)凝膠離子Ca2+有序可控的釋放，以達(dá)到海藻酸鈉微球凝膠固化的目的[7,8]。其原理示意圖下圖所示，將含有螯合物Ca-EDTA和海藻酸鈉的溶液作為水相1，含有螯合物Zn-EDDA和海藻酸鈉的溶液作為水相2；當(dāng)兩種水相混合后，因螯合劑與金屬離子的結(jié)合能力存在差異，Zn2+會(huì)與EDTA結(jié)合從而導(dǎo)致Ca2+的釋放，而被釋放的Ca2+與海藻酸鈉反應(yīng)實(shí)現(xiàn)凝膠固化。通過上述方式結(jié)合FluidicLab微滴制備平臺(tái)制備的海藻酸鈉凝膠微球是在中性、低離子濃度的溫和條件下進(jìn)行的，制備反微球粒徑均一性高，反應(yīng)速度快，凝膠固化時(shí)間短，大大減少對(duì)健康細(xì)胞的傷害。

實(shí)驗(yàn)材料：

試劑：

微滴生成油(Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)

破乳劑(Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)

海藻酸鈉(FluidicLab)

無水氯化鈣(Macklin, C805228-100 g)

EDTA溶液(Macklin, 0.5 M, pH 7.4, E885215-1L)

乙二胺-N, N′-二乙酸(EDDA, Macklin, E838453-5 G)

無水醋酸鋅(Macklin, E820824-25 G)

氫氧化鈉(Macklin, S817971-500 G)

PBS緩沖液粉末(Macklin, P854529-10EA)

耗材：

50?mL離心管(Falcon 50?mL REF 352098)若干

15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干

1.5/2?mL離心管若干

內(nèi)/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭

0.22 μm針式過濾器(PTFE材質(zhì))和注射器若干

芯片夾具：

PDMS-SCE-100/50/30?μm芯片(FluidicLab)

PDMS標(biāo)準(zhǔn)芯片夾具

設(shè)備：

Fluidiclab微滴/微球制備儀(三通道)

輔助設(shè)備：

電腦(Win10 以上系統(tǒng))

普通光學(xué)顯微鏡(用于測(cè)微球粒徑)

梅特勒托利多pH計(jì)

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.?試劑配制：

①?2 M CaCl2?溶液配制：

取2.2197 g的無水CaCl2?(MCaCl2=110.984 g/moL)加入超純水振蕩溶解，最終定容至10 mL備用。

②?2 % (wt%)海藻酸鈉溶液配制：

取0.2 g的海藻酸鈉固體粉末加入超純水超聲振蕩，60 ℃加熱輔助溶解，最終定容至10 mL備用。

③?2 M NaOH溶液配制

取1.6 g的NaOH(MNaOH=176.17 g/moL)加入超純水振蕩溶解，最終定容至20 mL備用。

④?80 mM Ca-EDTA溶液(pH=6.7)

取400 μL配制的2 M CaCl2與1.6 mL 的0.5 M EDTA振蕩均勻，加入5 mL超純水振蕩均勻，然后滴加2M NaOH調(diào)整pH至6.7左右，最終加入超純水定容至10 mL。

【注】下表加入體積供參考，實(shí)際加入量以pH值變化為準(zhǔn)。

⑤?80 mM Zn-EDDA溶液(pH=6.7)

取0.1465 g的無水Zn(CH3CHO2)2 (MZn(CH3CHO2)2=183.48 g/moL)與0.1416 g的乙二胺-N, N′-二乙酸(EDDA，MEDDA=176.17 g/moL)，加入5?mL超純水超聲振蕩溶解，然后滴加2M NaOH調(diào)整pH至6.7左右，最終加入超純水定容至10?mL。

【注】下表加入體積供參考，實(shí)際加入量以pH值變化為準(zhǔn)。

⑥?水相1配制(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Ca-EDTA)

取等體積80 mM Ca-EDTA溶液與1.2%海藻酸鈉溶液振蕩均勻得到分散相1，用0.22 μm針式過濾器過濾備用。

⑦?水相2配制(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Zn-EDDA)

取等體積80 mM Zn-EDDA溶液與1.2%海藻酸鈉溶液振蕩均勻得到分散相2，用0.22 μm針式過濾器過濾備用。

2.?海藻酸鈉微球制備：

1.?微滴/微球制備儀的安裝連接

微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊(cè)V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：

①?用氣管依次連接“空氣壓縮機(jī)”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”；

②?將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；

③?用氣管分別將A0(壓力輸出通道一)和A1(油相15 mL儲(chǔ)液池)，B0(壓力輸出通道二)和B1(水相1的2 mL儲(chǔ)液池)連接，C0(壓力輸出通道三)和C1(水相2的2 mL儲(chǔ)液池)；

④?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A1(油相15 mL儲(chǔ)液池)和A2(通道一流量傳感器)，B1(水相1的2 mL儲(chǔ)液池)和B2(通道二流量傳感器)連接，C1(水相2的2 mL儲(chǔ)液池)和C2(通道三流量傳感器)連接；

⑤?用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A2(通道一流量傳感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量傳感器)和B3(PDMS芯片的水相1入口)連接，C2(通道三流量傳感器)和C3(PDMS芯片的水相2入口)連接；

⑥?D為標(biāo)準(zhǔn)PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；

⑦?用PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口E處生成的乳液導(dǎo)出。

2.?FluidicLabSuite軟件的安裝和設(shè)備的添加：

FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊(cè)V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分(相機(jī)和流量傳感器僅需添加一次)。

3. 海藻酸鈉微滴的制備和固化：

具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應(yīng)用：微滴制備儀制備海藻酸鈉微球”)：

①?分別在15 mL油相儲(chǔ)液池(通道一)，2 mL水相1儲(chǔ)液池(通道二)和2 mL水相2儲(chǔ)液池(通道三)中依次加入5 mL微滴生成油，2 mL 水相1(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Ca-EDTA)和2 mL水相2(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Zn-EDDA)；

②?打開空氣壓縮機(jī)和氣源處理裝置開關(guān)；

③?在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；

④?在電腦端設(shè)置通道一壓力(油相，如250 mbar)、通道二壓力(水相1，如350 mbar)和通道三壓力(水相2，如350 mbar)排出管路和芯片中的空氣；

⑤?待管路和芯片中填充滿液體后(空氣被完全排出)，將整個(gè)系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設(shè)置通道一(油相)，通道二(水相1)和通道三(水相2)流速分別為20，5和5 μL/min；

⑥?調(diào)整反饋值(Feedback)快速達(dá)到設(shè)定流速，并實(shí)現(xiàn)流速的穩(wěn)定輸出；

⑦?用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學(xué)顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；

⑧?待微滴生成均勻后，即可開始接收1.5 mL離心管中；

⑨?一段時(shí)間后停止收集，密封于離心管中，靜置10 min固化。

4. 海藻酸鈉微球的破乳清洗：

具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應(yīng)用：微滴制備儀制備海藻酸鈉微球”)：

①?取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；

②?按V球：V破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；

③?1000 rpm離心處理30 s，并取出底部破乳劑；

④?重復(fù)上述②和③操作；

⑤?最終將得到海藻酸鈉微球分散于配制的PBS緩沖液中。

5. 微滴/微球制備儀清洗：

微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導(dǎo)卡”。

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結(jié)果與討論：

剛接收的微滴平均粒徑為101.74?μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=1.30%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

微滴交聯(lián)固化分散于PBS中的海藻酸鈉微球平均粒徑為96.08?μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.52%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

此外，我們也采用了不同類型的芯片制備了1%海藻酸鈉微球，其中水相1中Ca-EDTA和水相2中的Zn-EDDA濃度都為40 mM。具體參數(shù)如下表所示：

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