前言

方法學(xué)驗證的目的是證明所開發(fā)的方法能夠滿足檢測的要求。檢測的目的不同，對方法的要求也不同，驗證的程度也就不同。進(jìn)行方法學(xué)驗證簡單來說就是遵循官方指導(dǎo)原則（各國藥典、CDE、ICH等），對方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、定量限、檢測限、線性與范圍、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性等進(jìn)行驗證，證明其符合相關(guān)要求。

由于各項指導(dǎo)原則只是寬泛的描述與規(guī)定，并沒有具體操作和實施的細(xì)節(jié)，每個人對指導(dǎo)原則的理解不盡相同，因此對于方法學(xué)驗證可以說是千人千面，各有各的特色。方法學(xué)驗證并沒有絕對的對與錯之分，只要能客觀合理的證明方法的可行性，就是合格的方法學(xué)驗證。下面我將結(jié)合自己的方法學(xué)驗證經(jīng)驗談一談對方法學(xué)驗證的理解，探討方法驗證應(yīng)該怎么做，為什么要這么做，歡迎各位同仁多多交流。

一、需要驗證哪些指標(biāo)？

驗證指標(biāo)的確認(rèn)與方法的性質(zhì)相關(guān)，如對樣品雜質(zhì)限度檢查進(jìn)行驗證只需對其專屬性、檢測限和耐用性進(jìn)行驗證即可滿足限度檢查需求，無需對準(zhǔn)確度、精密度、檢測限、定量限、線性與范圍等與定量相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行驗證。對于雜質(zhì)的定量檢測，則需進(jìn)行專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測限、定量限、線性與范圍、耐用性等一系列的驗證方能證明其用于雜質(zhì)定量測定的可靠性。不論是哪種檢測需求，專屬性和耐用性驗證是必不可少的，這也是每一個分析方法必須滿足的基本要求。具體的驗證指標(biāo)設(shè)置可參照下表1。

a：已有重現(xiàn)性驗證，不需要驗證中間精密度

b：如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補充

c：視具體情況予以驗證

二、方法驗證內(nèi)容

2.1 專屬性

專屬性指在雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等其他組分可能存在的情況下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。對于專屬性不強方法，需采用不同原理的方法予以補充。

在方法學(xué)驗證過程中專屬性考察的方法包括定位試驗和降解試驗。

2.1.1 定位試驗

在雜質(zhì)對照品和輔料可以獲得的情況下，對于含量測定，可向供試品中加入雜質(zhì)或者輔料，與未加雜質(zhì)或者輔料的供試品測定結(jié)果比較，以此考察測定結(jié)果是否受干擾；對于雜質(zhì)檢查，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，考查雜質(zhì)之間分離度是否符合要求。

在做定位試驗時需要將各雜質(zhì)或輔料單獨進(jìn)樣，再將雜質(zhì)或輔料與API混合后進(jìn)樣，考察雜質(zhì)及輔料是否干擾目標(biāo)組分的測定。通常情況下，混合溶液中各雜質(zhì)的保留時間和峰面積與單獨定位時基本一致，但有時也會發(fā)生保留時間漂移或峰面積減小且同時產(chǎn)生新的雜質(zhì)峰的情況，對于保留時間漂移，最可能原因是受到了供試品溶液基質(zhì)的影響，由于實際情況下雜質(zhì)與供試品總是同時存在的，因此需以混合溶液中雜質(zhì)的保留時間為準(zhǔn)，而不以單獨定位時的保留時間為準(zhǔn)。對于峰面積減小且產(chǎn)生新雜質(zhì)的情況我們需要確定是哪些組分發(fā)生反應(yīng)，做定位時需現(xiàn)配現(xiàn)進(jìn)或?qū)l(fā)生反應(yīng)的組分分成兩個混合溶液分別進(jìn)行考察，避免反應(yīng)的發(fā)生。

2.1.2 降解試驗

降解試驗的目的是通過強制降解來研究潛在的降解雜質(zhì)和降解途徑對含量和雜質(zhì)測定的影響，以進(jìn)一步考察方法的專屬性。降解程度建議主峰歸一化純度降低5%~10%，如果通過很劇烈的條件供試品仍未發(fā)生明顯降解那么說明供試品很穩(wěn)定，在日常的運輸儲存和使用過程中不會發(fā)生難以預(yù)料的降解，因此無需進(jìn)一步降解。降解試驗完成后應(yīng)統(tǒng)計新增雜質(zhì)，同時對新增雜質(zhì)進(jìn)行LC-MS研究，結(jié)合API結(jié)構(gòu)特征和降解條件推測其結(jié)構(gòu)。

專屬性要求：

1）在專屬性試驗中各雜質(zhì)及輔料不干擾目標(biāo)組分的測定，待考察組分與相鄰峰分離度大于1.5。

2）各降解雜質(zhì)不干擾目標(biāo)組分的測定，降解物料守恒90%~110%之間（僅有關(guān)物質(zhì)）。

3）定位及降解試驗中目標(biāo)組分的色譜峰純度符合要求。

2.2 系統(tǒng)適用性

與儀器核查中的系統(tǒng)適用性不同，方法學(xué)驗證中的系統(tǒng)適用性是將儀器設(shè)備、試驗操作和被分析樣品作為一個整體來考察。凡是樣品檢測中需要用到的溶液（如有關(guān)物質(zhì)測定中的自身對照溶液、供試品溶液、混合溶液，含量測定的對照品溶液、供試品溶液等）均需要進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察。

系統(tǒng)適用性考察時將待考察溶液連續(xù)6針進(jìn)樣，計算保留時間、峰面積或雜質(zhì)含量RSD，同時考察待測組分的理論塔板數(shù)和拖尾因子及與相鄰峰的分離度是否符合要求。通常保留時間RSD≤1%，峰面積RSD≤2%，雜質(zhì)含量RSD可參照藥典四部9101方法學(xué)驗證指導(dǎo)原則精密度項下要求（見下表2）來設(shè)置。待測組分與相鄰雜質(zhì)分離度不小于1.5，理論塔板數(shù)可依據(jù)樣品及色譜柱的特點來設(shè)置，一般C18色譜柱理論塔板數(shù)會高些，SEC色譜柱塔板數(shù)會稍差，此外小分子化合物的理論塔板數(shù)高些，生物大分子理論塔板數(shù)低些，這個只要在規(guī)定的理論塔板數(shù)下能夠滿足專屬性、靈敏度或準(zhǔn)確性等驗證指標(biāo)的要求即可，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。拖尾因子一樣也沒有固定的要求，藥典中指出對于采用峰高計算的方法應(yīng)盡量將拖尾因子控制在0.95~1.05之間。在實際的驗證中通常都是采用峰面積計算，因此對拖尾因子的要求可適當(dāng)放寬，尤其是有關(guān)物質(zhì)檢測，在其他指標(biāo)符合要求的前提下拖尾因子可進(jìn)一步放寬。

2.3 檢測限

檢測限是指供試品中被測組分能被檢測出的最低量。檢測限的測定方法包括直觀法、信噪比法和基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，最常用的是信噪比法，要求檢測限信噪比≥3。

2.4 定量限

定量限是指供試品中待測組分能被定量測定的最低量。定量限的測定方法包括直觀法、信噪比法和基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，最常用的是信噪比法，要求定量限信噪比≥10。

在驗證方法的定量限時還需驗證定量限精密度及回收率。

定量限精密度是平行配制6份定量限溶液，計算6份溶液待測組分峰面積RSD，RSD限度要求參見精密度項下表2。

定量限回收率是向供試品中添加定量限水平的雜質(zhì)對照品（平行配制6份），外標(biāo)法計算其回收率并計算回收率RSD，回收率限度要求參見準(zhǔn)確度項下表3。

2.5 線性

線性關(guān)系是定量分析的基礎(chǔ)和必要條件，具體做法是采用對照品配制一系列濃度的溶液，有關(guān)物質(zhì)濃度設(shè)置范圍通常為定量限~限度200%，采用歸一化計算時主成分需做到100%供試品濃度；含量測定的線性范圍至少包含80%~120%，也可以根據(jù)需要放寬范圍，但要保證80%、100%和120%在線性考察點上。線性考察至少要設(shè)置5個濃度，然后以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作線性回歸，記錄線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性圖、殘差平方和，除此之外還應(yīng)考察Y軸截距和響應(yīng)因子。通常相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)不大于100%相應(yīng)2%（含量）或25%（雜質(zhì)含量），響應(yīng)因子RSD不大于10%。

--------校正因子：校正因子表示主成分與雜質(zhì)單位濃度相應(yīng)的比值，通常是采用主成分與雜質(zhì)線性斜率的比值計算，計算校正因子允許的誤差通常為10%，需由不同試驗人員在不同的儀器上進(jìn)行測定，以增加其準(zhǔn)確性和耐用性。通常校正因子在0.9~1.1可以采用不加校正因子的方法計算雜質(zhì)含量；當(dāng)校正因子超出這個范圍但在0.2~5.0時可以采用加校正因子的方法計算雜質(zhì)含量；當(dāng)校正因子<0.2或>5.0時需采用外標(biāo)法計算雜質(zhì)含量。校正因子小于1時保留兩位小數(shù)，大于1時保留一位小數(shù)，也就是保留兩位有效數(shù)字。舉個例子：如主成分線性斜率為56000，雜質(zhì)1線性斜率為59000，雜質(zhì)2線性斜率為52000，那么雜質(zhì)1的校正因子是0.95，雜質(zhì)2的校正因子是1.1。

2.6 范圍

范圍是指所開發(fā)方法能達(dá)到符合要求的精密度、準(zhǔn)確度和線性時的高低限濃度或量的區(qū)間。不同的驗證指標(biāo)范圍設(shè)置不同，通常線性≥準(zhǔn)確度≥精密度。推薦的范圍設(shè)置見下圖1。

▲ 圖1-線性、精密度及回收率通常設(shè)置的范圍

2.7 精密度

精密度指同一份均勻供試品在規(guī)定測定條件下經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度，一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度可以分為三個層次，重復(fù)性是在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果之間的精密度；中間精密度是在同一實驗室內(nèi)發(fā)生分析人員、檢測時間、儀器設(shè)備等隨機變動情況下所獲得測定結(jié)果之間的精密度；重現(xiàn)性是不同實驗室測定結(jié)果之間的精密度。

精密度考察有兩種方式，一是在規(guī)定范圍內(nèi)，取至少6份同一濃度（相當(dāng)于測定濃度100%水平）供試品的測定結(jié)果進(jìn)行評價；二是設(shè)計不少于3種不同濃度（通常為測定濃度80%、100%、120%水平），每種濃度配制不少于3份供試品溶液進(jìn)行測定和評價。目前第一種做法是普遍的做法。精密度結(jié)果的評價標(biāo)準(zhǔn)參照下表2設(shè)置。

▲ 表2-樣品中待測定成分的含量與精密度可接受范圍關(guān)系

2.8 準(zhǔn)確度：

準(zhǔn)確度一般用回收率來表示，表示方法測定值與真實值的接近程度，準(zhǔn)確度的測定方法參見下圖2。

▲ 圖2-準(zhǔn)確度測定方法

準(zhǔn)確度的限度設(shè)置可以參考下表3，當(dāng)基質(zhì)較復(fù)雜或待分析組分含量較低時也可適當(dāng)放寬限度。

▲ 表3-樣品中待測定成分的含量和回收率限度

2.9 耐用性

耐用性考察包含兩部分內(nèi)容，一是溶液穩(wěn)定性，二是色譜條件波動對檢測結(jié)果的影響。

2.9.1 溶液穩(wěn)定性

溶液穩(wěn)定性影響應(yīng)用此方法所獲得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、有效性。凡是樣品檢測中需要用到的溶液（如有關(guān)物質(zhì)測定中的自身對照溶液、供試品溶液、混合溶液，含量測定的對照品溶液、供試品溶液等）均需要進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保樣品檢測的可靠性。在進(jìn)行溶液穩(wěn)定性考察時首先應(yīng)考察25℃的穩(wěn)定性，如穩(wěn)定性較差可考察更低溫度下的穩(wěn)定性，此外如果25℃穩(wěn)定性極差應(yīng)注意樣品臨用新配或者考慮更換配制溶劑?？疾斓臅r間可根據(jù)需要或早期穩(wěn)定性的結(jié)果來設(shè)置。溶液穩(wěn)定性的評價可以采用偏差、平均偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于含量測定的供試品溶液、對照品溶液或有關(guān)物質(zhì)的自身對照溶液可以比較峰面積的變化，對于有關(guān)物質(zhì)的供試品溶液則應(yīng)考察單個雜質(zhì)含量、總雜質(zhì)含量、雜質(zhì)個數(shù)等多個指標(biāo)。

2.9.2 色譜條件耐用性

指測定結(jié)果不受測定條件微小變動影響的承受程度，考察耐用性可以為所建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。通常方法開發(fā)過程中就應(yīng)考慮其耐用性，如果測試條件要求苛刻，應(yīng)在方法中注明可以接受范圍。

色譜條件耐用性考察常見的波動范圍如下表4：

▲ 表4-耐用性色譜條件變化示意表

耐用性中色譜條件的變化范圍可以根據(jù)方法實際的耐用性作調(diào)整。在耐用性考察中除了考察含量、雜質(zhì)含量等，重要的一點是要考察各耐用性條件下的專屬性如何，可以通過考察各耐用性條件下混合溶液中待測組分與相鄰峰的分離度來評價。

三、小結(jié)

依據(jù)QbD理念，藥品不是檢驗出來的是設(shè)計出來的，與藥品一樣，分析方法不是驗證出來的，是設(shè)計出來的。在方法開發(fā)的過程中就應(yīng)充分考慮后續(xù)方法驗證的可行性，建立穩(wěn)健性較好的方法，為方法驗證提供一個較好的輸入。

其次，方法學(xué)驗證與所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是緊密相關(guān)的，當(dāng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生變更如雜質(zhì)限度修訂、殘留溶劑種類、生產(chǎn)工藝或制劑處方調(diào)整等都可能涉及到方法學(xué)的部分或重新驗證。在開展方法學(xué)驗證的過程中要理清到底為什么做方法學(xué)驗證，做哪些試驗可以證明方法的可靠性，怎樣合理設(shè)置各項指標(biāo)的控制限度，不要為了驗證而驗證，也不要做得千篇一律，要根據(jù)當(dāng)前研究階段對樣品質(zhì)量控制的需求進(jìn)行驗證，既不要過于粗獷也不要過度驗證。以上是我對于方法學(xué)驗證的一點個人看法，歡迎各位藥學(xué)同仁交流探討。

參考文獻(xiàn)：

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[2] ICH Q2(R1) Validation of Analytical Procedures Text and Methodology

[3] 化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導(dǎo)原則

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