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內(nèi)皮細(xì)胞(排列在血管管腔內(nèi)表面的特化細(xì)胞)在神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著至關(guān)重要的作用。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因。

既往AAV血清型改造主要集中于：轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞。相比之下，專門針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)其他細(xì)胞群(包括內(nèi)皮細(xì)胞)的AAV血清型相對較少，盡管人們開始認(rèn)識到大量的非神經(jīng)元細(xì)胞類型對神經(jīng)系統(tǒng)功能至關(guān)重要。

迄今為止，只有兩種有效轉(zhuǎn)導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的病毒載體被報道：AAV-PHP.V1[2]和AAV-BR1[3]。其中，AAV-PHP.V1在CNS中除了可以轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞外，還高效標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。相比之下，AAV-BR1特異性較高，但其靶向脊髓和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的能力是模糊的。

美國麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)布羅德研究所的Benjamin E. Deverman研究組和哈佛醫(yī)學(xué)院的Chenghua Gu研究組通過對AAV9血清型進(jìn)行一系列改造，開發(fā)了一種新血清型AAV-BI30。并于近日在Nat Cardiovasc Res雜志發(fā)表[1]。

AAV-BI30這種新血清型能夠特異且高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的內(nèi)皮細(xì)胞。在小鼠、大鼠模型和體外人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞中均能穩(wěn)定表達(dá)。

圖1 | DOI：10.1038/s44161-022-00046-4

AAV-BI30有效轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞

首先，作者驗(yàn)證了AAV-BI30對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性。在C57BL/6小鼠靜脈注射AAV-BI30，10d后皮層和海馬中可見明顯的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，而較少轉(zhuǎn)導(dǎo)外周器官微血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞。在大鼠中也有同樣的結(jié)果。

然而，在給藥約1周后，觀察到意外的劑量依賴性毒性（1×1011vg/只小鼠），表現(xiàn)為體重減輕、嗜睡行為等(如表中藍(lán)線)。加入肝細(xì)胞特異性microRNA靶序列miR122后，這種毒性及肝臟富集的情況消失。

圖2 | AAV-BI30標(biāo)記小鼠皮層和海馬內(nèi)皮細(xì)胞(左)，及miR122對肝臟富集/小鼠體重的影響

較AAV-BR1，AAV-BI30更優(yōu)

那么這種血清型與AAV-BR1相比，是否具有優(yōu)勢呢？

作者發(fā)現(xiàn)，在相同的注射條件下，AAV-BI30標(biāo)記的小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯多于AAV-BR1。同時，AAV-BI30的表達(dá)在整個大腦中沒有明顯的區(qū)域間差異，即皮質(zhì)、海馬、丘腦和小腦均表現(xiàn)出>80%的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，與AAV-BR1不同的是，AAV-BI30具有高度內(nèi)皮細(xì)胞特異性，標(biāo)記神經(jīng)元或星膠細(xì)胞的情況罕見。

圖3 | AAV-BI30與AAV-BR1標(biāo)記情況的差異

除毛細(xì)血管外，AAV-BI30對動脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也有高特異性

毛細(xì)血管，這種大腦中最小的血管，構(gòu)成了腦血管網(wǎng)絡(luò)的絕大部分。但除此之外，在軟腦膜中還分布著大動脈和靜脈，這是在腦切片中難以觀察到的。
為了觀察AAV-BI30對這部分血管的標(biāo)記情況，作者通過內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)錄因子ERG、α-平滑肌肌動蛋白與GFP的共標(biāo)識別。結(jié)果顯示，AAV-BI30能夠識別大部分動脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，這是在AAV-BR1未觀察到的。值得注意的是，AAV-BI30對大腦最大動脈同樣具有強(qiáng)大的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)(結(jié)果未顯示)。
這些結(jié)果都說明，即使在相對較低的劑量(1×1011vg)下，AAV-BI30仍能完成對全腦動脈、毛細(xì)血管和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高效且高特異性的標(biāo)記。

圖4 | AAV-BI30和AAV-BR1在軟腦膜血管中的轉(zhuǎn)導(dǎo)差異

AAV-BI30還能轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜和脊髓內(nèi)皮細(xì)胞

雖然迄今為止，大多數(shù)內(nèi)皮靶向的AAV研究都集中在腦血管系統(tǒng)上。但視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)也對血管生成、血腦屏障動力學(xué)、神經(jīng)血管病理學(xué)和許多其他關(guān)鍵過程的研究至關(guān)重要。因此，作者還評估了AAV-BI30轉(zhuǎn)導(dǎo)這些內(nèi)皮細(xì)胞的能力。

圖5所示，在視網(wǎng)膜的所有血管系統(tǒng)中，AAV-BI30顯著優(yōu)于AAV-BR1。在脊髓中也有類似的結(jié)果(結(jié)果未顯示)。這說明，AAV-BI30的高效、高內(nèi)皮細(xì)胞特異性嗜性并不局限于大腦；相反，它擴(kuò)展到了整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

圖5 | AAV-BI30視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記效果顯著優(yōu)于AAV-BR1

AAV-BI30可用于腦內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因調(diào)控

為了評估AAV-BI30在體內(nèi)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的基因調(diào)控能力，作者將AAV-BI30:CAG-Cre-miR122-WPRE注入Rosa26:CAG-LSL-tdTomata(Ai9)小鼠，表達(dá)12d后，在整個腦微血管系統(tǒng)以及位于軟腦膜表面的動脈和靜脈中均觀察到tdTomato的強(qiáng)表達(dá)。

圖6 | 內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因調(diào)控

作者還用小窩蛋白(Caveolin-1)敲除的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了AAV-BI30介導(dǎo)的Cre遞送的高度特異性。結(jié)果顯示，小窩蛋白的缺失只出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中，小動脈平滑肌細(xì)胞層中小窩蛋白表達(dá)則無明顯改變。這些都說明，AAV-BI30介導(dǎo)的Cre遞送具有高度特異性。

鑒于目前還沒有中樞系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的基因調(diào)控方案存在，AAV-BI30介導(dǎo)的Cre遞送系統(tǒng)可能成為常用的CDH5:CreERT2或TIE2:Cre等系統(tǒng)的良好替代。

圖7 | AAV-BI30介導(dǎo)的Cre傳遞實(shí)現(xiàn)了高效的內(nèi)皮特異性基因缺失

總 結(jié)

AAV-BI30是一種極具潛力的新型血清型，它在CNS中的嗜性幾乎只限于內(nèi)皮細(xì)胞，且無需借助特異性啟動子，因此具有廣泛的可操縱空間，非常適合各種類型的應(yīng)用。例如CNS內(nèi)皮細(xì)胞示蹤、細(xì)胞形態(tài)觀察、血管網(wǎng)絡(luò)重塑、功能調(diào)控、基因編輯、實(shí)時成像或雙組分調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)等。

這種血清型也非常適合加速我們對正常生理中神經(jīng)血管相互作用的理解，解決神經(jīng)血管疾病相關(guān)機(jī)理問題，并幫助開發(fā)治療內(nèi)皮功能障礙的治療方法。