高通量單細胞測序是近年來生物學領(lǐng)域最熱的技術(shù)之一，憑借其極高的分辨率能夠精準的剖析樣本細胞組成信息，結(jié)合高通量測序方式，進而大規(guī)模的揭示細胞間的異質(zhì)性。接下來我們整理了一些用戶經(jīng)常遇到的問題，分享給大家，希望可以為您答疑解惑。

Q1: 單細胞樣本取樣后不好保存怎么辦？

如果想要是短期保存，可以在取樣后進行清洗，添加適量的組織保存液，于4℃保存48h-72h。如果是長期保存，又想做單細胞測序，可在獲取樣本后，進行清洗剪碎，使用我們的組織凍存液進行梯度凍存，于-80℃長期保存，而且組織復蘇后，對細胞活率等影響也不大。如果取樣后對組織進行液氮冷凍，保存在-80℃，這種情況就建議提核了。

Q2: 單細胞免疫組庫測序和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序可以同時做么？送樣量會增加么？

這個是可以同時做的，在實驗油包水反轉(zhuǎn)成cDNA后，對cDNA進行擴增，這部分CDNA一部分可用于構(gòu)建單細胞文庫，一部分可用于構(gòu)建免疫組庫文庫。所以送樣量不會增加，和單細胞轉(zhuǎn)錄組的送樣要求相同。

Q3: 我的樣本不同時間獲得，會有批次效應么？

像單細胞測序，一個芯片同時只能測8個樣或16個樣，樣品多的情況下，都會有批次效應，而且樣本處理時間、處理人員等也有可能導致批次批次效應，但我們在后續(xù)分析時，會通過生信手段去除批次效應。

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Q4: 3‘ 轉(zhuǎn)錄組和5‘ 轉(zhuǎn)錄組有什么區(qū)別？

10x單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫有5‘端和3’端建庫兩種方式。在3’端的建庫中，Gel beads的末端序列是poly（dT），用于和轉(zhuǎn)錄組3’端的polyA結(jié)構(gòu)互補配對。而在5’端的建庫中，Gel beads的末端序列是TSO序列，其末端有polyG的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄本會在酶的作用下在其5‘端加上polyC的結(jié)構(gòu)，由此完成配對。

VDJ建庫的捕獲固定采用5’端捕獲方法，目的是為了在保證序列長度較短的情況之下富集到位于5’端的多變VDJ區(qū)域，而不是位于3’端的較為保守的C區(qū)域，這段區(qū)域通常不是重點的研究方向。

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Q5: 哪些組織建議做單細胞核測序？

像含有心肌細胞、脂肪細胞，神經(jīng)細胞的組織，由于細胞比較大，更建議提核。不過腦組織也有做單細胞懸液的，關(guān)鍵看您是更關(guān)注神經(jīng)元，還是更關(guān)注其他細胞，如果做提核的話，神經(jīng)元細胞比例會接近真實水平，如果做單細胞懸液，由于酶刺激或過篩等操作，會導致神經(jīng)元細胞相對少一些。

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Q6: 都是單細胞測序，10X單細胞測序和smart-seq有什么區(qū)別？

smart-seq是一個細胞建一個文庫，因此價格是按照細胞數(shù)目進行計算的，這決定了當細胞通量達到較大數(shù)值時，項目預算會非常巨大。10X是一個樣本一個文庫，單個樣本的細胞數(shù)目是幾千到一萬，因此價格核算到細胞水平，每個細胞的價格在幾元。因此10X單細胞測序更有利于高通量的單細胞轉(zhuǎn)錄組研究。Smart-seq是一個全長轉(zhuǎn)錄組的測序，10X單細胞只針對3’端或5’端的150bp的測序，因此，如果想要關(guān)注全轉(zhuǎn)錄本的序列，smart-seq是更好的選擇。

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Q7: 在制備細胞懸液時候，活率低，結(jié)團率高，是否可以繼續(xù)實驗？

一般來說，單細胞懸液質(zhì)檢要求：細胞活率＞80%, 細胞結(jié)團率＜10% ,活細胞濃度范圍: 400 ~ 1000 cells/μl,有核率＞70%。但也應根據(jù)具體實驗材料而定，細胞活率70%也有成功案例，結(jié)團率30%也有成功案例。

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Q8: 在樣本質(zhì)檢合格的情況下，一般情況下細胞數(shù)在預期細胞數(shù)的0.5-2倍之間，細胞數(shù)與預期相差較大的原因有哪些？

1. 樣本質(zhì)量與特點：如樣本活性/有核率/是否含中性粒/是否含色素等；

2. 細胞計數(shù)的準確性：現(xiàn)有技術(shù)以對通透性的檢測的結(jié)果代替細胞活性，這個方法并不完全準確，有時候會測到的活性很好，實際上沒那么好的情況；

3. 操作的準確性；

4.10X油包水過程的情況：油包水過程本身沒法指控，大體上是穩(wěn)定的，但有一些時候會不正常，極端的時候就是油包水基本沒生成，這個可被肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，但界于中間的一些狀態(tài)無法肉眼判斷，比如油包水實際效率下降了，但仍然生成了乳濁狀態(tài)，這個也有可能是細胞數(shù)偏差的一個原因；

5. 與單細胞識別的算法有關(guān)，算法是依據(jù)標準樣本做的模型，對于質(zhì)量低的樣本有時可能會造成細胞數(shù)偏差增大。

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Q9: Fraction Reads in Cell出現(xiàn)報警是什么原因？（低于70%)

1.環(huán)境中RNA含量較高，這種環(huán)境RNA來自樣本中裂解/死亡的細胞?？赡苁菢颖緺顟B(tài)不佳導致。

2.RNA含量變化可能比預期的要高，也就是RNA含量低的細胞更多，但是Cell Ranger將barcode劃分成細胞或者是背景的時候，是根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的情況進行劃分，所以有的細胞因為RNA含量低而被當成了背景。

3.存在非特異性擴增，出現(xiàn)了非特異性片段較多，導致背景中reads較多。

但無論是哪種情況，都不影響我們后續(xù)的使用 ，因為我們后續(xù)分析都是有效的reads。

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王貝 | 文案

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關(guān)于百奧益康

北京百奧益康醫(yī)藥科技有限公司致力于提供前沿的單細胞及空間組學全套解決方案，相關(guān)研發(fā)和服務團隊位于北京亦莊。

百奧益康現(xiàn)有管理和技術(shù)團隊具有豐富的單細胞及空間組學服務和研發(fā)經(jīng)驗，在該研究領(lǐng)域深耕7年，已累積150+不同組織類型、10,000+個樣品的服務經(jīng)驗，服務客戶發(fā)文超百篇，影響因子超千分（包括CNS頂級期刊）。

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