細胞增殖和細胞死亡間平衡的維持對多種細胞有機的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，其失衡將導致各種疾病的發(fā)生.如：人類平均每天有6×10（10）個新細胞生成，同時又接近同等數(shù)量的成熟細胞被機體清除.在細胞增殖及細胞凋亡間存在一種配對關(guān)系，因此區(qū)分活細胞和死細胞對研究生長條件的控制和細胞死亡過程都是十分重要的.

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BioVision活-死細胞染色試劑盒提供了即用型試劑來方便地區(qū)分死細胞和活細胞.利用Live-Dye染料來對活細胞染色，這是一種能穿透細胞的綠色熒光染料（Ex/Em = 488/518 nm）.死細胞可以簡單的用碘化吡啶（PI）染色，一種不能透過細胞膜的紅色熒光染料（Ex/Em = 488/615）.染上色的活細胞和死細胞通過使用了濾光片（檢測FITC和羅丹明）的熒光顯微鏡可以直接從視覺上區(qū)分開來.該試劑盒提供的試劑可以在24孔板上染色100次.

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活-死細胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit（K501-100）操作步驟：

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（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

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（二）構(gòu)建重組表達載體

1、活-死細胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

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（三）??獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

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1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

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（四）誘導表達

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1、 活-死細胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml,?離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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