? ? ? ?將目的片段插入到質粒的指定位點，一種成熟的方法是利用PCR擴增目的片段，然后利用酶切酶連將片段插入載體中。但是實驗中我曾遇到這幾種情況：1、質粒是低拷貝的，提取濃度較低，又在經(jīng)過酶切純化之后損失較大。后續(xù)經(jīng)過多次方法改進才提高質粒濃度。2、部分質粒長度較大，一些試劑盒不滿足其長度范圍，需要購買新的試劑盒，對于像我所在的這種貧困的實驗室是一筆巨額。3、對于已經(jīng)構建好的質粒，插入的片段需要進行刪減、添加部分片段。等等

? ? ?TPCR以原產(chǎn)載體為模板進行PCR擴增，隨后將PCR產(chǎn)物當長引物，以受體載體為模板再次進行PCR全質粒擴增，以此將目的片段整合到受體載體中，無需中間產(chǎn)物純化，也無需任何商業(yè)試劑盒。最后用DpnI處理后的PCR產(chǎn)物進行轉化。

? ? ? 該方法所用的高保真酶最好是適合長片段擴增。

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? ? ? 引物設計、PCR操作等注意事項詳見文獻[1]。

參考文獻：

[1] Erijman A, Dantes A, Bernheim R, Shifman JM, Peleg Y. Transfer-PCR (TPCR): a highway for DNA cloning and protein engineering. J Struct Biol. 2011 Aug;175(2):171-7. doi: 10.1016/j.jsb.2011.04.005. Epub 2011 Apr 15. PMID: 21515384.