流式細胞術(shù)細胞活力概述

流式細胞術(shù)提供了一種快速可靠的方法來量化細胞懸液中的活細胞。 在評估細胞的生理狀態(tài)時，例如對細胞毒性藥物和環(huán)境因素的反應(yīng)，或在癌癥和其他疾病狀態(tài)的進展過程中，確定細胞活力至關(guān)重要。 此外，通常需要檢測細胞懸液中的死細胞，以便將其排除在分析之外。 由于非特異性抗體結(jié)合或不需要的熒光探針攝取，死細胞會產(chǎn)生偽影。 識別這兩個細胞群的一種方法是通過染料排除。 活細胞具有完整的膜，可排除多種染料，這些染料很容易穿透無活力細胞的受損、可滲透的膜。

幾種不同的熒光染料可用于染色非活細胞，包括 7-氨基放線菌素 D (7-AAD)。 7-AAD 是一種膜不透性染料，通常被活細胞排除在外。 它通過插入富含 G-C 區(qū)域的堿基對與雙鏈 DNA 結(jié)合。 7-AAD 可以用氬激光在 488 nm 處激發(fā)。 它具有相對較大的斯托克斯位移，最大波長為 647 nm。 由于這些光譜特性，7-AAD 可以與其他在 488 nm 處激發(fā)的熒光染料結(jié)合使用，例如異硫氰酸熒光素 (FITC) 和藻紅蛋白 (PE)。

以下方案已由 R&D Systems 流式細胞術(shù)實驗室開發(fā)和優(yōu)化，用于使用 7-AAD 進行細胞活力染色。

所需試劑

• PBS (1X)：0.137 M NaCl、0.05 M NaH2PO4、pH 7.4 或 Hank 平衡鹽溶液 (HBSS；1X)

• 流式細胞染色緩沖液或含有 BSA 和疊氮化鈉的等效溶液

• 7-AAD 染色溶液：1 mg/mL 7-AAD 在 PBS 中（在黑暗中儲存在 2-8 °C）

所需材料

• FACS? 管（5 mL 圓底聚苯乙烯管）

• 移液器吸頭和移液器

• 離心機

• 渦旋

步驟

1.收獲細胞并將最多 1 x 106 個細胞/100 μL 等分到 FACS 管中。通過加入 2 mL PBS（或 HBSS）清洗細胞，以 300 x g 離心 5 分鐘，然后從沉淀的細胞中傾析緩沖液。重復(fù)洗滌步驟共 2 次。

注意：此時可以使用抗體對細胞表面抗原進行染色。標記細胞內(nèi)分子時不能使用 7-AAD。

2.在 100 μL 流式細胞儀染色緩沖液中重懸細胞。

3.要調(diào)整 7-AAD 的流式細胞儀設(shè)置，請將 5-10 μL 的 7-AAD 染色溶液添加到未染色細胞的控制管中。輕輕混合并在 4 °C 避光孵育 30 分鐘。

4.使用 FACScan? 儀器測定 7-AAD 熒光（使用 FL-2 或 FL-3 通道）。

注意：如果僅使用 7-AAD 染色，則使用 FL-2 通道。如果細胞也被 FITC 和/或 PE 偶聯(lián)抗體染色，則在 FL-3 通道中收集 7-AAD 熒光。

5.獲取未染色細胞和單色陽性對照的數(shù)據(jù)。

6.在每個樣品中加入 5-10 μL 的 7-AAD 染色溶液，并在分析前在 4 °C 下在黑暗中孵育 30 分鐘。從前向散射與 7-AAD 的點圖中設(shè)置活細胞的停止計數(shù)。

注意：加入 7-AAD 染色液后不要洗滌細胞。