腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的 80%～90%。環(huán)狀RNA(circRNAs)在RCC發(fā)生和進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被確定，但它們的功能、分子機(jī)制和潛在的臨床應(yīng)用仍然知之甚少，所以明確腎細(xì)胞癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于疾病監(jiān)測(cè)和治療策略研發(fā)具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circRNAs）屬于非編碼RNA的一個(gè)亞類，通過反向剪切形成[1]。其中，通過母基因的5’端及3’端連接在一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。早期的研究認(rèn)為，circRNA是不可編碼的[2]，然而，隨著測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)算法的迭代更新，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有潛在功能的circRNA[3]。在腎細(xì)胞癌（RCC）中，hsa_circ_0057105具有雙重作用調(diào)控機(jī)制。一方面，它通過激活EMT上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)RCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另一方面，它也增加了RCC細(xì)胞的鐵死亡敏感性。這表明在hsa_circ_0057105的調(diào)節(jié)下，RCC細(xì)胞需要在“攻擊性”和“氧化敏感性”之間做出選擇。

2023年7月26日，中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科黃勇/Jin Xiaohan/羅俊航團(tuán)隊(duì)在Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）發(fā)表文章【Hsa_circ_0057105 modulates a balance of epithelial-mesenchymal transition and ferroptosis vulnerability in renal cell carcinoma】。結(jié)果顯示，hsa_circ_0057105具有潛在的致癌作用，可能調(diào)節(jié)腎細(xì)胞癌中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的激活。hsa_circ_0057105增強(qiáng)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并通過抑制hsa-miR-577的表達(dá)來調(diào)節(jié)COL1A1和VDAC2的表達(dá)，后者可以誘導(dǎo)RCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)鐵死亡的敏感性。作者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了hsa_circ_0057105的體內(nèi)效應(yīng)。

一、高通量測(cè)序鑒定EMT相關(guān)的差異表達(dá)circRNA及hsa_circ_0057105表征

作者通過對(duì)腎癌細(xì)胞及癌旁組織進(jìn)行RNA-seq分析，鑒定到了212個(gè)差異表達(dá)的circRNA，在癌細(xì)胞及癌旁組織的單樣本基因富集分析ssGSEA中發(fā)現(xiàn)EMT通路的激活與腎細(xì)胞癌有著很大的關(guān)聯(lián)。而EMT途徑在癌組織及癌旁組織存在顯著差異，且通過差異表達(dá)的circRNA與EMT的ssGSEA進(jìn)行全面的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)了hsa_circ_0057105，其與EMT通路的ssGSEA的評(píng)分相關(guān)性最顯著。通過染色體定位/背靠背及線性引物設(shè)計(jì)/qRT-PCR/Sanger測(cè)序/RNase R/FISH定位檢測(cè)hsa_circ_0057105的成環(huán)/特異表達(dá)/穩(wěn)定性/細(xì)胞定位。其中，hsa_circ_0057105在四種腎癌細(xì)胞系的表達(dá)量要顯著高于正常細(xì)胞系，暗示其可能具有致癌功能。

二、多樣本下hsa_circ_0057105的表征

作者收集了130對(duì)癌組織及癌旁組織樣本，通過qRT-PCR/FISH實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)癌組織呈現(xiàn)彌漫性，hsa_circ_0057105的表達(dá)要高于癌旁組織，隨著臨床期的進(jìn)度及Fuhrman分級(jí)發(fā)展，hsa_circ_0057105的表達(dá)顯著增加，同時(shí)hsa_circ_0057105的高表達(dá)患者組中的總體生存率及無復(fù)發(fā)生存率較低。

三、hsa_circ_0057105在RCC細(xì)胞系中發(fā)揮作用及分子海綿機(jī)制

作者使用了針對(duì)hsa_circ_0057105環(huán)化位點(diǎn)的siRNA干擾序列，轉(zhuǎn)染siRNA的RCC細(xì)胞具有較低的遷移和侵襲能力；同時(shí)，作者評(píng)估了EMT通路相關(guān)的標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)，上皮標(biāo)記物E-cad上升，間質(zhì)標(biāo)記物N-cad和Vimentin下降。過表達(dá)hsa_circ_0057105后，增加了RCC細(xì)胞的侵襲能力，且EMT通路標(biāo)記物的表達(dá)水平與敲低hsa_circ_0057105相比呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。

同時(shí)，作者使用了ENCORI和circular RNA interactome database 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了26個(gè)與hsa_circ_0057105互作的miRNA，其中通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定了miR-577與hsa_circ_0057105互作最為顯著，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)顯示它們共定位于細(xì)胞質(zhì)，還通過了兩者的特異性探針pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩者的互作。表型研究表明，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后，RCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。綜上表明，miR-577作為hsa_circ_0057105的海綿效應(yīng)靶點(diǎn)。

四、RCC細(xì)胞系中miR-577分子海綿機(jī)制下游探索

作者為了鑒定miR-577調(diào)控的基因，使用miR-577抑制劑處理組和對(duì)照組進(jìn)行測(cè)序以及GSEA、GO分析發(fā)現(xiàn)，其下游調(diào)控的靶基因參與EMT通路及線粒體代謝，并從中篩選出處理后表達(dá)上調(diào)且與患者生存率顯著相關(guān)的3個(gè)靶基因：I型膠原蛋白(collagen type I alpha 1 chain, COL1A1)、電壓依賴性陰離子通道成孔蛋白(voltage dependent anion channel 2, VDAC2)、脫氧胞苷酸脫氨酶(deoxycytidylate deaminase ,DCTD)，其中COL1A1及VDAC2的3’UTR區(qū)存在特異性的靶標(biāo)序列，可直接被miR-577所調(diào)控，并通過雙熒光素酶和pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它們的互作，進(jìn)一步證明了COL1A1和VDAC2是miR-577的直接靶點(diǎn)。

五、RCC細(xì)胞系中COL1A1及VDAC2靶基因效應(yīng)

通過TCGA KIRC數(shù)據(jù)庫(kù)的GSEA分析表明COL1A1參與EMT通路，同樣COL1A1高表達(dá)導(dǎo)致患者總體生存率及無復(fù)發(fā)生存率較低。相關(guān)性分析顯示其EMT標(biāo)記物中E-cad表達(dá)較低，N-cad和vimentin表達(dá)較高，這與過表達(dá)hsa_circ_0057105所激活的EMT通路一致。即COL1A1過表達(dá)增強(qiáng)了RCC細(xì)胞的遷移和侵襲，RCC細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，但不影響細(xì)胞增殖。

作者發(fā)現(xiàn)miR-577的靶基因VDAC2可以控制細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間離子和代謝物的交換，GSEA分析發(fā)現(xiàn)RCC細(xì)胞VDAC2的高表達(dá)與鐵死亡升高相關(guān)，暗示了VDAC2高表達(dá)的RCC細(xì)胞容易受到鐵死亡誘導(dǎo)的氧化損傷。在對(duì)照組下，VDAC2并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，在添加鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin時(shí)，其能夠抑制VDAC2，并加速鐵、丙二醛的積累及GSSG的產(chǎn)生和GSH的降低，但是在COL1A1中并沒有觀察到類似的現(xiàn)象。也就是說，在這種RCC細(xì)胞的鐵死亡現(xiàn)象中，VDAC2作為增效劑而不是直接誘導(dǎo)作用。

六、hsa_circ_0057105調(diào)控miR-577/COL1A1/VDAC2通路來平衡RCC細(xì)胞和生物體內(nèi)的EMT及鐵死亡誘導(dǎo)機(jī)制

作者為了進(jìn)一步探索相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)了miR-577抑制劑/模擬物在hsa_circ_0057105基因敲低/過表達(dá)的腎癌細(xì)胞系中進(jìn)行了回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)敲低/過表達(dá)hsa_circ_0057105時(shí)會(huì)抑制/增強(qiáng)RCC細(xì)胞的遷移和侵襲，而再分別添加miR-577抑制劑及模擬物時(shí)這種現(xiàn)象又會(huì)回補(bǔ)，這一點(diǎn)在WB驗(yàn)證中也觀察到類似的現(xiàn)象。

作者通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa_circ_0057105且添加鐵死亡激活劑Erastin的轉(zhuǎn)化小鼠對(duì)鐵死亡敏感性增強(qiáng)，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。皮下腫瘤的免疫組織化學(xué)染色顯示，過表達(dá)組中COL1A1、VDAV2和EMT標(biāo)記物被激活的變化有所增加。在小鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)組導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移速率增加及轉(zhuǎn)移病灶，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明了hsa_circ_0057105對(duì)激活EMT通路和誘導(dǎo)鐵死亡具有雙重作用。

總結(jié)

作者研究發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌（RCC）中，hsa_circ_0057105具有雙重作用調(diào)控其發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制。一方面，它通過激活EMT上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)RCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另一方面，它也增加了RCC細(xì)胞的鐵死亡敏感性。這表明在hsa_circ_0057105的調(diào)節(jié)下，RCC細(xì)胞需要在“攻擊性”和“氧化敏感性”之間做出選擇。該研究為RCC中EMT與鐵死亡之間的關(guān)系提供了新的見解，并為RCC的監(jiān)測(cè)和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1339

參考文獻(xiàn)：

[1] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK,Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019;20(11):675-691.

[2] Cocquerelle C, Mascrez B, Hetuin D, Bailleul B. Mis-splicing yields circular RNA molecules. FASEB J. 1993;7(1):155-160.

[3] Salzman J, Chen RE, Olsen MN, Wang PL, Brown PO. Celltype specific features of circular RNA expression. PLoS Genet.2013;9(9):e1003777.