今天給同學(xué)們分享一篇生信文章“Identification of therapeutic targets for osteosarcoma by integrating single-cell RNA sequencing and network pharmacology”，這篇文章于2023年1月6日發(fā)表在Front Pharmacol期刊上，影響因子為5.6。

骨肉瘤（OS）是一種惡性腫瘤，主要發(fā)生在兒童和青少年身上，占全球原發(fā)性骨腫瘤的20%。目前，骨肉瘤的治療方法主要包括手術(shù)、化療和放療。然而，目前對(duì)骨肉瘤的治療方法仍然不盡人意，總體5年生存率為65%至70%。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的骨肉瘤治療選擇。

1. 細(xì)胞群集的識(shí)別和降維分析

通過(guò)scRNA-seq分析，鑒定出了21個(gè)細(xì)胞亞型和八種細(xì)胞類(lèi)型（圖1A、B）。八種細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因表達(dá)在不同細(xì)胞類(lèi)型之間存在差異（圖1C）。KEGG富集分析顯示八種細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因在富集通路上存在顯著的異質(zhì)性（圖1D）。

圖1 細(xì)胞群集的鑒定和降維分析

2. 不同細(xì)胞類(lèi)型的收集

為了進(jìn)一步篩選OS中的不同細(xì)胞類(lèi)型，使用CIBERSORT算法分析了GSE36001數(shù)據(jù)集中OS和正常組織中八種細(xì)胞類(lèi)型的豐度（圖2A）。研究表明，免疫檢查點(diǎn)TDO2、PDCD1、LGALS9和PVR在癌癥治療和預(yù)后中起著重要作用（Stamm等，2018；Fan等，2020；Miao等，2020；Cui等，2022）?；赑earson相關(guān)分析，篩選出與免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平顯著相關(guān)的細(xì)胞豐度，并結(jié)果顯示B細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、內(nèi)皮細(xì)胞和漿細(xì)胞的豐度分別與免疫檢查點(diǎn)TDO2（p = .043）、PDCD1（p = .017）、LGALS9（p = .017）和PVR（p = .026）顯著相關(guān)（圖2B）。

圖2 不同細(xì)胞類(lèi)型的收集

3. 篩選出關(guān)鍵基因

從Genecards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到了共計(jì)4,236個(gè)與OS相關(guān)的靶點(diǎn)。接下來(lái)，與四種細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因進(jìn)行交集，作者得到了289個(gè)共同的靶點(diǎn)（圖3A）。最后，通過(guò)Pearson相關(guān)性分析進(jìn)一步篩選，得到了17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（GZMB、IL1A、IGFBP4、JUN、KDR、CD2、FLT1、CCR7、CD4、COL9A3、SPRY4、OMD、RUNX2、PTPRG、HSPA1A、SOX18和PDGFRB），這些靶點(diǎn)與四種差異細(xì)胞的豐度顯著相關(guān)（圖3B）。

圖3 篩選出OS的關(guān)鍵目標(biāo)

隨后，作者通過(guò)TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了與OS生存時(shí)間信息相對(duì)應(yīng)的17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)數(shù)據(jù)。通過(guò)多元Cox回歸分析，這五個(gè)靶點(diǎn)（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3、JUN）可能是重要的預(yù)后因子。基于多元Cox回歸算法構(gòu)建了由這五個(gè)基因組成的聯(lián)合預(yù)后標(biāo)記模型。結(jié)果顯示，這五個(gè)關(guān)鍵基因能夠準(zhǔn)確評(píng)估OS的風(fēng)險(xiǎn)（p = .0019，圖4A）。此外，在OS的3年和5年生存分析中，ROC曲線下的面積（AUC）值大于0.72（圖4B）。

圖4 OS中五個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）的預(yù)后分析

此外，癌細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)蛋白來(lái)逃避免疫反應(yīng)。為了驗(yàn)證五個(gè)關(guān)鍵基因的高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)分組的準(zhǔn)確性，檢測(cè)了免疫檢查點(diǎn)BTLA和PDL1的表達(dá)。低風(fēng)險(xiǎn)組中BTLA和PDL1（CD274）的表達(dá)水平高于高風(fēng)險(xiǎn)組（圖4C）。

4. PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能富集分析

通過(guò)使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，共獲得161對(duì)互補(bǔ)關(guān)系（圖5）。進(jìn)行了GO和KEGG富集分析以探索這17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能。GO富集分析顯示出787個(gè)富集通路（p <.05），其中生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）的前五個(gè)通路如圖6A所示。BP主要與ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)、MAPK級(jí)聯(lián)和趨化作用相關(guān)。CC位于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物和細(xì)胞外側(cè)的質(zhì)膜。MF與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、生長(zhǎng)因子結(jié)合和蛋白酪氨酸激酶活性相關(guān)。同時(shí)，KEGG富集分析在77個(gè)通路（p <.05）中富集，主要包括MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和人T細(xì)胞白血病病毒一感染（圖6B）。

圖5 17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

圖6 17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能豐富分析

5. 藥物-靶點(diǎn)相互作用預(yù)測(cè)

使用deepDR算法，獲得了與OS高分關(guān)聯(lián)的十種藥物。使用DeepPurpose算法預(yù)測(cè)了17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與這十種藥物之間的相互作用關(guān)系（圖7）。篩選得分大于75%四分位數(shù)的結(jié)果得到了六種藥物（DB04572、DB01005、DB01234、DB00541、DB00570和DB00309），可能作用于17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖7 藥物靶點(diǎn)相互作用評(píng)分分散點(diǎn)

為了確認(rèn)這六種藥物是否適用于骨肉瘤的治療，作者使用AutoDock Vina對(duì)六種藥物和CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN進(jìn)行了分子對(duì)接分析。對(duì)接結(jié)果顯示，RUNX2與長(zhǎng)春新堿（DB00541）、長(zhǎng)春堿（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的結(jié)合親和力；OMD與長(zhǎng)春新堿（DB00541）、長(zhǎng)春堿（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的結(jié)合親和力；CD4與長(zhǎng)春新堿（DB00541）、長(zhǎng)春堿（DB00570）和地塞米松（DB01234）具有良好的結(jié)合親和力（圖8）。

圖8 對(duì)VCR、DEX和VLB與RUNX2、OMD和CD4的分子對(duì)接分析

6. 細(xì)胞驗(yàn)證試驗(yàn)

為了評(píng)估關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)OS的預(yù)后效果，使用qRT-PCR檢測(cè)CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN在OS和成骨細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與hFOB1.19細(xì)胞相比，OS細(xì)胞中CD4、OMD和JUN的表達(dá)下降，而RUNX2和COL9A3的表達(dá)增加（p < .01；圖9）。

圖9 使用qRT-PCR檢測(cè)了CD4、OMD、JUN、COL9A3和RUNX2的相對(duì)表達(dá)水平

總結(jié)

總之，根據(jù)細(xì)胞豐度的差異，在OS和正常組織中鑒定出四種細(xì)胞類(lèi)型（B細(xì)胞、CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞和漿細(xì)胞）。作者確定了五個(gè)與OS進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)（CD4、RUNX2、OMD、COL9A3和JUN）。GO和KEGG分析表明，這五個(gè)基因與免疫調(diào)節(jié)途徑有關(guān)。長(zhǎng)春新堿、地塞米松和長(zhǎng)春堿可能與RUNX2、OMD和CD4形成一對(duì)有前景的藥物靶點(diǎn)，用于OS治療。然而，作者的研究仍然存在不足。例如，作者只對(duì)生物信息學(xué)結(jié)果進(jìn)行了簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者的結(jié)果缺乏臨床結(jié)果的支持。作者的研究確定了治療OS的潛在靶點(diǎn)。