2023年10月19日，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院張衛(wèi)東帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39.3）雜志上發(fā)表題為《Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456》的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)一種新的小分子HHQ16，它是黃芪甲苷IV的衍生物，通過直接作用于心肌細(xì)胞來逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，有效地逆轉(zhuǎn)梗死誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)和改善心功能。在本研究中，作者使用了漢恒生物的在體研究工具產(chǎn)品：AAV-lnc9456，并使用了ctnt特異性啟動(dòng)子，用于心肌細(xì)胞中l(wèi)nc9456的特異性過表達(dá)。

心肌梗死（MI）后心室重構(gòu)是心力衰竭（HF）最常見的原因。心肌損傷導(dǎo)致負(fù)荷突然增加，從而引發(fā)神經(jīng)體液級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并誘發(fā)一種獨(dú)特的心臟重構(gòu)模式，其特征是全身擴(kuò)張和遠(yuǎn)端非梗死性心臟肥厚。遠(yuǎn)端肥厚與心肌梗死后重構(gòu)過程中的心功能障礙相似，是心衰發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心肌細(xì)胞大小和腔室?guī)缀涡螤罨謴?fù)到正常的水平，心功能的改善。這一過程被稱為重塑可逆性，是治療梗死性心衰的一種很有希望的方法。

黃芪是臨床上治療慢性心衰的常用中藥。黃芪的主要有效成分為黃芪甲苷。近十年來，科學(xué)證據(jù)表明，黃芪甲苷可顯著逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性慢性心力衰竭的不良重構(gòu)，但其直接作用靶點(diǎn)和作用尚不清楚。因此，黃芪甲苷可能為新藥開發(fā)提供有價(jià)值的候選化合物。本研究優(yōu)化了一種新型黃芪甲苷小分子衍生物HHQ16，該衍生物通過直接作用于心肌細(xì)胞產(chǎn)生抗肥厚作用，有效逆轉(zhuǎn)心肌梗死后重構(gòu)，改善心功能。

下面，我們一起來了解具體的研究內(nèi)容：

1.?一種新的小分子HHQ16可顯著改善梗死性心衰小鼠心功能，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)

作者篩選出一種新的小分子衍生物HHQ16，并研究HHQ16對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎(LADL)引起的HF小鼠缺血的影響。結(jié)果表明，接受10 mg/kg HHQ16治療的小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）發(fā)生明顯改善。同時(shí)，HHQ16顯著降低增大后的心臟尺寸和心臟重量與體表面積之比(HW/BSA)。H&E和Masson染色顯示，HHQ16通過減少細(xì)胞體積以及纖維化，顯著逆轉(zhuǎn)了LADL誘導(dǎo)的肥大。HHQ16也恢復(fù)了線粒體形態(tài)。綜上所述，這些結(jié)果證明HHQ16治療可以有效逆轉(zhuǎn)LADL誘導(dǎo)的小鼠心功能惡化和結(jié)構(gòu)重塑。

圖1 HHQ16顯著改善心功能，逆轉(zhuǎn)心衰小鼠心肌重構(gòu)

2.?HHQ16直接作用于心肌細(xì)胞產(chǎn)生抗肥厚作用

為了研究HHQ16對(duì)HF影響的分子機(jī)制，采用RNA-seq分析了差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，包括蛋白編碼mRNA和長鏈非編碼RNA (lncRNAs)。作者發(fā)現(xiàn)，受HHQ16影響的差異mRNA主要富集于擴(kuò)張型心肌病和肥厚型心肌病，以及肥厚標(biāo)記物β-MHC、ANP和BNP，提示HHQ16對(duì)心臟肥厚具有突出的調(diào)節(jié)作用。LADL誘導(dǎo)的ANP、BNP和β-MHC的增加被HHQ16逆轉(zhuǎn)。

采用異丙腎上腺素(ISO)、Ang II或苯腎上腺素(PE)刺激心肌細(xì)胞作為體外心肌肥大模型。HHQ16限制了ISO + PE刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞體積擴(kuò)張。HHQ16還逆轉(zhuǎn)了ISO刺激引起的ANP和BNP肥厚表達(dá)的增加。這些數(shù)據(jù)表明，通過HHQ16治療，肥厚心肌細(xì)胞可以恢復(fù)到接近正常的大小，這可能是HHQ16逆轉(zhuǎn)梗死誘導(dǎo)的重構(gòu)和HF作用的原因。

圖2 HHQ16通過直接作用于心肌細(xì)胞抑制心肌肥厚

3.HHQ16的作用與對(duì)lnc9456的強(qiáng)烈抑制有關(guān)

LncRNAs通?？梢哉{(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)，在生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，所以作者進(jìn)一步分析lncRNAs測序數(shù)據(jù)，共鑒定出小鼠心臟中35個(gè)lncRNA，其中HF中12個(gè)下調(diào)lncRNA被HHQ16上調(diào)，HF中23個(gè)上調(diào)lncRNA被HHQ16下調(diào)。lnc9456是一個(gè)位于10號(hào)染色體上Egr2基因上游的GM32255基因的轉(zhuǎn)錄本。HHQ16顯著抑制ISO、Ang II或ISO + PE誘導(dǎo)的原代或HL-1心肌細(xì)胞中l(wèi)nc9456的高表達(dá)，說明HHQ16對(duì)心肌肥厚和HF的影響與對(duì)新的Egr2相關(guān)轉(zhuǎn)錄物lnc9456的強(qiáng)烈抑制有關(guān)。

圖3 一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本lnc9456被HHQ16強(qiáng)烈抑制

4.?Lnc9456對(duì)心肌細(xì)胞肥大至關(guān)重要

Lnc9456在正常心臟中幾乎檢測不到，但在LADL治療的肥大和衰竭小鼠心臟中以及體外肥厚心肌細(xì)胞中高表達(dá)，并伴有ANP和BNP等肥厚生物標(biāo)志物表達(dá)的平行增加，提示lnc9456可能是驅(qū)動(dòng)心肌細(xì)胞肥厚的致病因子。為了確定lnc9456在心肌細(xì)胞肥大中的功能作用，作者還在HL-1小鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)lnc9456，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)lnc9456的心肌細(xì)胞明顯增大，標(biāo)志物ANP、BNP和β-MHC在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的表達(dá)也較高。而沉默lnc9456后，ISO + PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚作用也被消除。

圖4 Lnc9456對(duì)心肌細(xì)胞肥大至關(guān)重要

5.?Lnc9456與G3BP2相互作用，促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路

為探討lnc9456對(duì)心肌細(xì)胞肥厚影響的潛在下游機(jī)制，作者使用catRAPID篩選可能與lnc9456相互作用的潛在蛋白。G3BP2與lnc9456直接相互作用的概率最高。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，小鼠的LADL引起G3BP2表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加。當(dāng)lnc9456的表達(dá)受到干擾時(shí)，G3BP2的蛋白水平下降；而lnc9456高表達(dá)時(shí)，G3BP2的蛋白水平相應(yīng)升高。作者通過共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了lnc9456的過表達(dá)能夠增強(qiáng)G3BP2與IκBα的結(jié)合，并促進(jìn)NF-κB亞基p65的核聚集。

圖5?Lnc9456與G3BP2相互作用，促進(jìn)NF-κB p65亞基的核易位

6.?Lnc9456是HHQ16逆轉(zhuǎn)小鼠心臟肥厚和功能障礙所必需的

Lnc9456是促肥厚因子，而HHQ16可顯著降低肥厚心臟及心肌細(xì)胞中Lnc9456的水平，提示HHQ16可能通過靶向Lnc9456實(shí)現(xiàn)心肌肥厚及HF的作用。作者進(jìn)一步探討HHQ16如何調(diào)控lnc9456的表達(dá)。結(jié)果顯示，HHQ16顯著降低了lnc9456的半衰期，并且仍然能夠降低AdV -lnc9456誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中l(wèi)nc9456的高表達(dá)，強(qiáng)烈暗示這種調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，作者在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中進(jìn)一步檢測了HHQ16對(duì)lnc9456穩(wěn)定性的影響。HHQ16降低體外轉(zhuǎn)錄的lnc9456水平呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。微尺度熱電泳(MST)數(shù)據(jù)顯示HHQ16與lnc9456具有高親和力，但對(duì)抗肥厚lncRNA Mhrt沒有任何親和力。因此，HHQ16可以特異性結(jié)合lnc9456并促進(jìn)其在心肌細(xì)胞中的降解。

圖6?HHQ16直接與lnc9456高親和力結(jié)合，誘導(dǎo)其降解

7.?Lnc9456是HHQ16逆轉(zhuǎn)小鼠心臟肥厚和功能障礙所必需的

考慮到HHQ16可以降解體外轉(zhuǎn)錄的lnc9456，作者進(jìn)一步評(píng)估了增加的lnc9456對(duì)心臟的影響以及HHQ16在體內(nèi)的作用。過表達(dá)AAV-lnc9456的小鼠心臟呈現(xiàn)出心肌肥厚和功能障礙。HHQ16處理可以降低心臟中l(wèi)nc9456的高水平，并在心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)lnc9456的小鼠中恢復(fù)重構(gòu)相關(guān)的變化，進(jìn)一步支持HHQ16通過轉(zhuǎn)錄后抑制lnc9456發(fā)揮作用。

同時(shí)，為了評(píng)估lnc9456功能喪失對(duì)心臟和體內(nèi)HHQ16活性的影響，生成了lnc9456CKO小鼠。結(jié)果表明，HHQ16僅在lnc9456f/f小鼠中表現(xiàn)出抑制心肌肥厚和HF的作用，而在lnc9456CKO小鼠中沒有，這表明lnc9456是HHQ16逆轉(zhuǎn)心肌肥厚和HF的特異性靶點(diǎn)。

圖7?Lnc9456是HHQ16逆轉(zhuǎn)小鼠心臟肥厚和功能障礙所必需的

8.?人類同源物lnc4012是HHQ16的真正靶點(diǎn)

作者發(fā)現(xiàn)lnc9456的同源物lnc4012是HHQ16在人心臟中的靶點(diǎn)，并在人心肌細(xì)胞AC16進(jìn)一步驗(yàn)證了上述的結(jié)果，證實(shí)了小鼠lnc9456和人lnc4012分子機(jī)制是一致的。而HHQ16對(duì)lnc4012的親和力要高于小鼠同源物lnc9456，并以時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)體外轉(zhuǎn)錄的lnc4012的降解。在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞(iPSC-CMs)中， HHQ16顯著降低ISO誘導(dǎo)的lnc4012的表達(dá)，支持HHQ16逆轉(zhuǎn)病理性肥大和HF的真正靶點(diǎn)。

圖8?人類同源物lnc4012是HHQ16的真正靶點(diǎn)

綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)一種新的小分子HHQ16，黃芪甲苷IV的衍生物，通過直接逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有的心肌肥大，逆轉(zhuǎn)梗死誘導(dǎo)的不良重構(gòu)和HF。為lnc4012/lnc9456在心肌梗死誘導(dǎo)的肥厚和心衰發(fā)展中的作用提供了新的機(jī)制見解。研究證明lnc4012/lnc9456是一個(gè)新的小分子HHQ16的真正靶點(diǎn)，通過特異性結(jié)合lnc4012/lnc9456，導(dǎo)致其降解，并拮抗其對(duì)心肌細(xì)胞G3BP2/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的作用，有效逆轉(zhuǎn)梗死誘導(dǎo)的肥厚和HF。小分子靶向降解病理性增加的lnc4012/lnc9456可能是一種新的有希望的治療肥厚和HF的策略。