2022年12月25日，同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院王凱教授團(tuán)隊(duì)在cells（IF:7.666）在線發(fā)表了題為“Human Placental Endothelial Cell and T rophoblast Heterogeneity and Differentiation Revealed by Single-Cell RNA Sequencing”的研究論文。該研究揭示了胎盤細(xì)胞的復(fù)雜性，并展示了妊娠早期胎盤內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路，這將為未來(lái)人類胎盤發(fā)育的研究提供資源。

期刊：Cells

影響因子：7.666

發(fā)表年月：2022.12.25

材料：妊娠6-16周的選擇性終止妊娠中采集11份健康胎盤樣本

方法：10×Genomics scRNA-seq

研究背景

胎盤的正常生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)胎兒和產(chǎn)婦的健康至關(guān)重要，胎盤功能障礙可導(dǎo)致嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥，如子癇前期、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胎盤增生。出于倫理方面的考慮，人類胎盤發(fā)育的研究具有挑戰(zhàn)性，近年來(lái)新技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了人們的認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)了對(duì)胎盤發(fā)育的遺傳和表觀遺傳調(diào)控的理解。最近的研究研究創(chuàng)建了正常和病理?xiàng)l件下人類胎盤轉(zhuǎn)錄組的圖譜。然而，很少有人對(duì)人類胎盤內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的分子特征和異質(zhì)性進(jìn)行識(shí)別和分析，因此，在胎盤的研究中仍有更多的細(xì)節(jié)有待完善。

研究結(jié)果

Result1 正常人類妊娠早期和中期胎盤的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

作者從胎齡6-16周選擇性終止妊娠中收集了11份健康的胎盤絨毛樣本，進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序(圖1A)，經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，共獲得52,179個(gè)數(shù)據(jù)。降維聚類后，共獲得8個(gè)Cluster，包括滋養(yǎng)細(xì)胞 (EVTs、SCTs、VCTs)、巨噬細(xì)胞、霍夫鮑爾細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(圖1B,C)。

通過(guò)對(duì)每個(gè)發(fā)育階段每種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組模式進(jìn)行分層聚類分析(圖1D)，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組表型在妊娠6至7周之間以及妊娠8至9周后的樣本之間相似，這意味著8 ~ 9孕周可能是妊娠早期胎盤細(xì)胞基因表達(dá)譜變化的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

圖1 | 胎齡6-16周人胎盤樣本的單細(xì)胞圖譜

Result2 人胎盤中不同內(nèi)皮細(xì)胞簇的鑒定和特征

作者通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞亞型進(jìn)行聚類分析，獲得了三個(gè)主要的EC聚類(Endo-1，-2和-3)(圖2A)，每個(gè)聚類都有其代表性標(biāo)記（圖2B），并且發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞簇的比例有所不同(圖2C)。

通過(guò)對(duì)三個(gè)細(xì)胞簇的差異基因(DEGs)分析發(fā)現(xiàn)(圖2D,E)，Endo-2可能是胎盤局部血管祖細(xì)胞或未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞；Endo-1可能是一組在妊娠早期經(jīng)歷內(nèi)皮增殖和血管形成的細(xì)胞；Endo-是孕中期的主要細(xì)胞類型，表現(xiàn)出更加分化和成熟的血管內(nèi)皮特征。

擬時(shí)序和RNA velocity分析顯示分化較低的一側(cè)主要由Endo-2組成，而分化較多的一側(cè)主要由Endo -1和Endo -3占據(jù)(圖2I、H)，并且Endo-2是三個(gè)分化軌跡的根源:自我更新、分化為Endo-1和Endo-3(圖2J)，確定Endo-1細(xì)胞也表現(xiàn)出向Endo -3的方向和數(shù)量。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了Endo-2作為胎盤血管祖細(xì)胞的分類。

圖2 | 孕早期和孕中期胎盤內(nèi)皮細(xì)胞亞型分析

Result3不同胎盤內(nèi)皮細(xì)胞群的代謝轉(zhuǎn)錄組特征

通過(guò)GSVA分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)EC簇表現(xiàn)出不同的代謝基因特征(圖3A-E)。Endo-2中，參與糖酵解的基因上調(diào)(圖3A)，脂質(zhì)代謝基因在三種內(nèi)皮細(xì)胞簇中的分布不明確(圖3B)。Endo-1中大部分參與TCA代謝的基因均升高(圖3C)，在妊娠早期通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞分化和增殖的Endo-1細(xì)胞可能依賴于TCA循環(huán)和合成代謝旁通路。氧化磷酸化基因信號(hào)主要在Endo-2和Endo-1中上調(diào)(圖3D)，Endo-3作為孕中期主要的EC簇，主要進(jìn)行糖酵解代謝而不是氧化糖代謝。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的代謝需求是亞型或階段依賴的。

圖3 | 胎盤內(nèi)皮細(xì)胞的代謝異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異質(zhì)性

Result4 轉(zhuǎn)錄因子在不同胎盤內(nèi)皮細(xì)胞簇中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

SCENIC分析表明，Endo-1中有多個(gè)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(圖3F)，其他上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子及其網(wǎng)絡(luò)也可能在人類胎盤EC早期分化和血管成熟中發(fā)揮重要作用。許多由關(guān)鍵內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)的調(diào)控因子在Endo-3中富集，結(jié)果證明Endo-3細(xì)胞具有血管生成表型，激活一系列與血管功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

Result5?胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞亞群

作者通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序獲得16,819個(gè)數(shù)據(jù)，降維聚類后得到8個(gè)亞群，包括5個(gè)VCT亞群、2個(gè)EVT亞群和1個(gè)SCT亞群(圖4A)，表明在妊娠早期和中期絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層存在高度異質(zhì)性。為了研究不同聚類之間的異質(zhì)性，作者對(duì)各VCT亞型進(jìn)行差異表達(dá)基因的熱圖(圖4C)和GO分析(圖4D)，發(fā)現(xiàn)VCT-5和SCT的基因表達(dá)模式高度相似(圖4F)，VCT-5細(xì)胞中的DEGs參與上皮細(xì)胞分化(圖4D)，SCT高表達(dá)基因在VCT-5中也有上調(diào)。

接下來(lái)，作者分析了所有滋養(yǎng)層簇中合胞素相關(guān)基因集的表達(dá)水平(圖4D-G)，發(fā)現(xiàn)在孕早中期胎盤絨毛中至少存在四種功能不同的VCT亞群：具有分化潛能或已經(jīng)進(jìn)入分化路徑的細(xì)胞包括EVT前體細(xì)胞和SCT前體細(xì)胞；未進(jìn)入分化路徑的細(xì)胞包括絨毛中的非增殖性VCT和增殖活躍VCT。

圖4 | 人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞亞型鑒定

Result6 人類滋養(yǎng)細(xì)胞祖細(xì)胞有助于EVT分化

VCT-3作為一個(gè)活躍的增殖亞群（圖4E），具有VCT到EVT分化的基因表達(dá)特征（圖4D和5A）。因此作者通過(guò)免疫熒光和染色（圖5B-D）發(fā)現(xiàn)，VCT-3中的細(xì)胞充當(dāng)有絲分裂活性的滋養(yǎng)層祖細(xì)胞，具有形成EVT生長(zhǎng)的潛力。

圖5 | 人滋養(yǎng)層祖細(xì)胞有助于EVT譜系

Result7?VCT與EVT的鑒別分析

作者將EVTs聚為兩個(gè)亞群：EVT-1中的DEGs與錨定連接、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、運(yùn)動(dòng)和粘附的調(diào)節(jié)以及整合素細(xì)胞表面相互作用有關(guān)(圖6A)。EVT-2中的DEGs與免疫反應(yīng)激活、炎癥反應(yīng)、mRNA代謝和翻譯相關(guān)(圖6B)，熒光染色發(fā)現(xiàn)EVT-2(圖6C)與VCT-3同樣表達(dá)EMT相關(guān)基因(圖6D)。擬時(shí)序分析結(jié)果說(shuō)明(圖6E-G)，EVT-2可能代表了一個(gè)早期分化階段，特征為抗炎和免疫調(diào)節(jié)，EVT標(biāo)記基因低表達(dá)，并存在EMT標(biāo)記。與此同時(shí)，EVT-1細(xì)胞處于成熟階段，其運(yùn)動(dòng)、黏附、侵襲等功能受到調(diào)控。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)受體信號(hào)通路和整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路在EVT-1和EVT-2中富集，并且TGF-β信號(hào)受體表達(dá)從EVT-2到EVT-1逐漸升高(圖6H)。幾種TGF-β信號(hào)配體在EVT-1中也被上調(diào)(圖6H)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明TGF-β信號(hào)通路在EVTs分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。并且作者還發(fā)現(xiàn)了EVT-1、EVT-2和VCT-3之間的許多相互作用，包括與免疫調(diào)節(jié)、粘附和細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的相互作用(圖6J)。

圖6 | EVT 亞型和擬時(shí)序分析

Result8?其他細(xì)胞類型

作者發(fā)現(xiàn)不同的巨噬細(xì)胞高表達(dá)基因不同，起源也不同，分別來(lái)自于胎兒和母體。為了進(jìn)一步分析孕早期和孕中期免疫細(xì)胞的差異，作者探索了妊娠6-7周和14-16周的DEGs及GO功能。數(shù)據(jù)表明，霍夫鮑爾細(xì)胞經(jīng)歷了從妊娠早期到妊娠中期的功能成熟過(guò)，孕早期和孕中期母體巨噬細(xì)胞也表現(xiàn)出功能差異(圖7B-E)。

通過(guò)擬時(shí)序分析來(lái)研究紅系細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程(圖7F)，不同的分支代表了紅系細(xì)胞的不同階段（圖7G,H）。結(jié)果表明，從妊娠早期胎盤中獲得的促紅細(xì)胞主要包括巨核紅細(xì)胞祖細(xì)胞和早期促紅細(xì)胞分化階段的細(xì)胞。而處于狀態(tài)3的細(xì)胞主要存在于妊娠6-7周的樣本中，并在妊娠9周左右顯著轉(zhuǎn)變?yōu)闋顟B(tài)1和狀態(tài)2(圖7I)。

成纖維細(xì)胞被分為四個(gè)亞群。并且被認(rèn)為是高度可塑性的細(xì)胞群，在不同成纖維細(xì)胞簇之間具有不同的基因表達(dá)模式。

圖7 | 免疫細(xì)胞和紅系細(xì)胞分析

文章總結(jié)

作者通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序分析，提供了妊娠6-16周人類胎盤發(fā)育的高分辨率分子圖譜，分析了每種胎盤細(xì)胞類型的細(xì)胞亞型復(fù)雜性，驗(yàn)證了胎盤內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性，以更好地了解正常胎盤內(nèi)皮功能和活性的分子決定因素，并且在VCTs中鑒定了兩種不同的祖細(xì)胞群，分別分化為EVTs和SCTs。這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了對(duì)調(diào)節(jié)人類胎盤發(fā)育的分子和細(xì)胞機(jī)制的理解。

DOI：https://doi.org/10.3390/cells12010087