2022年12月25日，同濟大學附屬第一婦嬰保健院王凱教授團隊在cells（IF:7.666）在線發(fā)表了題為“Human Placental Endothelial Cell and T rophoblast Heterogeneity and Differentiation Revealed by Single-Cell RNA Sequencing”的研究論文。該研究揭示了胎盤細胞的復(fù)雜性，并展示了妊娠早期胎盤內(nèi)皮細胞和滋養(yǎng)細胞分化的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和信號通路，這將為未來人類胎盤發(fā)育的研究提供資源。

期刊：Cells

影響因子：7.666

發(fā)表年月：2022.12.25

材料：妊娠6-16周的選擇性終止妊娠中采集11份健康胎盤樣本

方法：10×Genomics scRNA-seq

研究背景

胎盤的正常生長發(fā)育對胎兒和產(chǎn)婦的健康至關(guān)重要，胎盤功能障礙可導(dǎo)致嚴重的妊娠并發(fā)癥，如子癇前期、宮內(nèi)生長受限、胎盤增生。出于倫理方面的考慮，人類胎盤發(fā)育的研究具有挑戰(zhàn)性，近年來新技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了人們的認識，增強了對胎盤發(fā)育的遺傳和表觀遺傳調(diào)控的理解。最近的研究研究創(chuàng)建了正常和病理條件下人類胎盤轉(zhuǎn)錄組的圖譜。然而，很少有人對人類胎盤內(nèi)皮細胞(ECs)的分子特征和異質(zhì)性進行識別和分析，因此，在胎盤的研究中仍有更多的細節(jié)有待完善。

研究結(jié)果

Result1 正常人類妊娠早期和中期胎盤的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析

作者從胎齡6-16周選擇性終止妊娠中收集了11份健康的胎盤絨毛樣本，進行單細胞測序(圖1A)，經(jīng)過質(zhì)控后，共獲得52,179個數(shù)據(jù)。降維聚類后，共獲得8個Cluster，包括滋養(yǎng)細胞 (EVTs、SCTs、VCTs)、巨噬細胞、霍夫鮑爾細胞、紅細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞(圖1B,C)。

通過對每個發(fā)育階段每種細胞類型的轉(zhuǎn)錄組模式進行分層聚類分析(圖1D)，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞類型的轉(zhuǎn)錄組表型在妊娠6至7周之間以及妊娠8至9周后的樣本之間相似，這意味著8 ~ 9孕周可能是妊娠早期胎盤細胞基因表達譜變化的關(guān)鍵時間點。

圖1 | 胎齡6-16周人胎盤樣本的單細胞圖譜

Result2 人胎盤中不同內(nèi)皮細胞簇的鑒定和特征

作者通過對內(nèi)皮細胞亞型進行聚類分析，獲得了三個主要的EC聚類(Endo-1，-2和-3)(圖2A)，每個聚類都有其代表性標記（圖2B），并且發(fā)現(xiàn)三種細胞簇的比例有所不同(圖2C)。

通過對三個細胞簇的差異基因(DEGs)分析發(fā)現(xiàn)(圖2D,E)，Endo-2可能是胎盤局部血管祖細胞或未成熟的內(nèi)皮細胞；Endo-1可能是一組在妊娠早期經(jīng)歷內(nèi)皮增殖和血管形成的細胞；Endo-是孕中期的主要細胞類型，表現(xiàn)出更加分化和成熟的血管內(nèi)皮特征。

擬時序和RNA velocity分析顯示分化較低的一側(cè)主要由Endo-2組成，而分化較多的一側(cè)主要由Endo -1和Endo -3占據(jù)(圖2I、H)，并且Endo-2是三個分化軌跡的根源:自我更新、分化為Endo-1和Endo-3(圖2J)，確定Endo-1細胞也表現(xiàn)出向Endo -3的方向和數(shù)量。這些數(shù)據(jù)進一步支持了Endo-2作為胎盤血管祖細胞的分類。

圖2 | 孕早期和孕中期胎盤內(nèi)皮細胞亞型分析

Result3不同胎盤內(nèi)皮細胞群的代謝轉(zhuǎn)錄組特征

通過GSVA分析發(fā)現(xiàn)，三個EC簇表現(xiàn)出不同的代謝基因特征(圖3A-E)。Endo-2中，參與糖酵解的基因上調(diào)(圖3A)，脂質(zhì)代謝基因在三種內(nèi)皮細胞簇中的分布不明確(圖3B)。Endo-1中大部分參與TCA代謝的基因均升高(圖3C)，在妊娠早期通過內(nèi)皮細胞分化和增殖的Endo-1細胞可能依賴于TCA循環(huán)和合成代謝旁通路。氧化磷酸化基因信號主要在Endo-2和Endo-1中上調(diào)(圖3D)，Endo-3作為孕中期主要的EC簇，主要進行糖酵解代謝而不是氧化糖代謝。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明胎盤血管內(nèi)皮細胞的代謝需求是亞型或階段依賴的。

圖3 | 胎盤內(nèi)皮細胞的代謝異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異質(zhì)性

Result4 轉(zhuǎn)錄因子在不同胎盤內(nèi)皮細胞簇中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

SCENIC分析表明，Endo-1中有多個上調(diào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(圖3F)，其他上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子及其網(wǎng)絡(luò)也可能在人類胎盤EC早期分化和血管成熟中發(fā)揮重要作用。許多由關(guān)鍵內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的調(diào)控因子在Endo-3中富集，結(jié)果證明Endo-3細胞具有血管生成表型，激活一系列與血管功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

Result5?胎盤滋養(yǎng)層細胞亞群

作者通過單細胞測序獲得16,819個數(shù)據(jù)，降維聚類后得到8個亞群，包括5個VCT亞群、2個EVT亞群和1個SCT亞群(圖4A)，表明在妊娠早期和中期絨毛細胞滋養(yǎng)層存在高度異質(zhì)性。為了研究不同聚類之間的異質(zhì)性，作者對各VCT亞型進行差異表達基因的熱圖(圖4C)和GO分析(圖4D)，發(fā)現(xiàn)VCT-5和SCT的基因表達模式高度相似(圖4F)，VCT-5細胞中的DEGs參與上皮細胞分化(圖4D)，SCT高表達基因在VCT-5中也有上調(diào)。

接下來，作者分析了所有滋養(yǎng)層簇中合胞素相關(guān)基因集的表達水平(圖4D-G)，發(fā)現(xiàn)在孕早中期胎盤絨毛中至少存在四種功能不同的VCT亞群：具有分化潛能或已經(jīng)進入分化路徑的細胞包括EVT前體細胞和SCT前體細胞；未進入分化路徑的細胞包括絨毛中的非增殖性VCT和增殖活躍VCT。

圖4 | 人胎盤滋養(yǎng)層細胞的細胞亞型鑒定

Result6 人類滋養(yǎng)細胞祖細胞有助于EVT分化

VCT-3作為一個活躍的增殖亞群（圖4E），具有VCT到EVT分化的基因表達特征（圖4D和5A）。因此作者通過免疫熒光和染色（圖5B-D）發(fā)現(xiàn)，VCT-3中的細胞充當有絲分裂活性的滋養(yǎng)層祖細胞，具有形成EVT生長的潛力。

圖5 | 人滋養(yǎng)層祖細胞有助于EVT譜系

Result7?VCT與EVT的鑒別分析

作者將EVTs聚為兩個亞群：EVT-1中的DEGs與錨定連接、細胞外結(jié)構(gòu)組織、運動和粘附的調(diào)節(jié)以及整合素細胞表面相互作用有關(guān)(圖6A)。EVT-2中的DEGs與免疫反應(yīng)激活、炎癥反應(yīng)、mRNA代謝和翻譯相關(guān)(圖6B)，熒光染色發(fā)現(xiàn)EVT-2(圖6C)與VCT-3同樣表達EMT相關(guān)基因(圖6D)。擬時序分析結(jié)果說明(圖6E-G)，EVT-2可能代表了一個早期分化階段，特征為抗炎和免疫調(diào)節(jié)，EVT標記基因低表達，并存在EMT標記。與此同時，EVT-1細胞處于成熟階段，其運動、黏附、侵襲等功能受到調(diào)控。

轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)受體信號通路和整合素介導(dǎo)的信號通路在EVT-1和EVT-2中富集，并且TGF-β信號受體表達從EVT-2到EVT-1逐漸升高(圖6H)。幾種TGF-β信號配體在EVT-1中也被上調(diào)(圖6H)。這些發(fā)現(xiàn)說明TGF-β信號通路在EVTs分化過程中起關(guān)鍵作用。并且作者還發(fā)現(xiàn)了EVT-1、EVT-2和VCT-3之間的許多相互作用，包括與免疫調(diào)節(jié)、粘附和細胞信號通路相關(guān)的相互作用(圖6J)。

圖6 | EVT 亞型和擬時序分析

Result8?其他細胞類型

作者發(fā)現(xiàn)不同的巨噬細胞高表達基因不同，起源也不同，分別來自于胎兒和母體。為了進一步分析孕早期和孕中期免疫細胞的差異，作者探索了妊娠6-7周和14-16周的DEGs及GO功能。數(shù)據(jù)表明，霍夫鮑爾細胞經(jīng)歷了從妊娠早期到妊娠中期的功能成熟過，孕早期和孕中期母體巨噬細胞也表現(xiàn)出功能差異(圖7B-E)。

通過擬時序分析來研究紅系細胞的細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程(圖7F)，不同的分支代表了紅系細胞的不同階段（圖7G,H）。結(jié)果表明，從妊娠早期胎盤中獲得的促紅細胞主要包括巨核紅細胞祖細胞和早期促紅細胞分化階段的細胞。而處于狀態(tài)3的細胞主要存在于妊娠6-7周的樣本中，并在妊娠9周左右顯著轉(zhuǎn)變?yōu)闋顟B(tài)1和狀態(tài)2(圖7I)。

成纖維細胞被分為四個亞群。并且被認為是高度可塑性的細胞群，在不同成纖維細胞簇之間具有不同的基因表達模式。

圖7 | 免疫細胞和紅系細胞分析

文章總結(jié)

作者通過單細胞測序分析，提供了妊娠6-16周人類胎盤發(fā)育的高分辨率分子圖譜，分析了每種胎盤細胞類型的細胞亞型復(fù)雜性，驗證了胎盤內(nèi)皮細胞的異質(zhì)性，以更好地了解正常胎盤內(nèi)皮功能和活性的分子決定因素，并且在VCTs中鑒定了兩種不同的祖細胞群，分別分化為EVTs和SCTs。這些發(fā)現(xiàn)促進了對調(diào)節(jié)人類胎盤發(fā)育的分子和細胞機制的理解。

DOI：https://doi.org/10.3390/cells12010087