寫在前面

????????今天推薦的是由美國西北大學(xué) Feinberg 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系在2020年1月13日發(fā)表于Journal of Experimental Medicine（2020IF：14.307，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Deyu Fang教授，研究表明USP22通過MED1抑制組蛋白H2A單泛素化來控制iNKT免疫。

研究背景

????????iNKT細(xì)胞在連接先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用，并與傳染病、過敏、哮喘、自身免疫和腫瘤監(jiān)測有關(guān)。泛素途徑已被證明可調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞免疫，但尚未確定參與該過程的去泛素化酶。

摘要部分

????????在此，作者發(fā)現(xiàn)泛素特異性肽酶22(USP22)在iNKT細(xì)胞的早期發(fā)育階段1中高度表達(dá)。USP22缺陷以細(xì)胞固有方式阻止了iNKT細(xì)胞發(fā)育過程中從階段1到2的過渡。USP22抑制也減少了iNKT17和iNKT1的分化，但有利于iNKT2極化而不改變傳統(tǒng)的T細(xì)胞激活和分化。USP22與Mediator complex subunit 1(MED1)相互作用，MED1是一種參與iNKT細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄共激活因子。有趣的是，在與MED1相互作用時，USP22不作為去泛素化酶來抑制MED1泛素化以使其穩(wěn)定。相反，USP22通過去泛素化組蛋白H2A而不是H2B單泛素化來增強(qiáng)MED1對IL-2Rβ和T-bet基因表達(dá)的功能。因此，作者的研究揭示了USP22介導(dǎo)的組蛋白H2A去泛素化微調(diào)MED1轉(zhuǎn)錄激活，這是一種以前未被重視的控制iNKT發(fā)育和功能的分子機(jī)制。

研究內(nèi)容

1.iNKT細(xì)胞發(fā)育需要USP22??? ?

????????作者首先分析了USP22在T細(xì)胞和iNKT細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測到其在iNKT細(xì)胞中的高表達(dá)。進(jìn)一步分析表明，USP22表達(dá)在iNKT發(fā)育第1階段上調(diào)，在第2階段進(jìn)一步增加，表明USP22可能在iNKT免疫中發(fā)揮重要作用。作者通過用Lck-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)USP22floxed小鼠（USP22條件突變小鼠）產(chǎn)生了T細(xì)胞特異性USP22條件性KO（USP22 cKO）小鼠。進(jìn)一步的細(xì)胞內(nèi)染色分析表明，來自WT和USP22 cKO小鼠的大部分免疫細(xì)胞的比例沒有明顯變化。有趣的是，流式細(xì)胞術(shù)分析檢測到USP22 cKO小鼠胸腺中TCRβ和NK1.1陽性iNKT細(xì)胞群與其WT同窩對照相比減少了90%。使用CD1d-αGalCer四聚體的進(jìn)一步分析證實(shí)了胸腺中iNKT細(xì)胞群的減少，表明USP22對小鼠iNKT細(xì)胞的產(chǎn)生至關(guān)重要。

研究結(jié)論：iNKT細(xì)胞發(fā)育需要USP22的參與。

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2.USP22以細(xì)胞固有方式調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育

????????為了確定USP22是否以細(xì)胞固有方式調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育，作者通過用CD45.1+ WT和CD45.2+ USP22 cKO骨髓細(xì)胞的1:1混合物，將其重構(gòu)到輻照后的CD45.1+ WT受體中，進(jìn)而來產(chǎn)生骨髓嵌合體。來自USP22 cKO的供體骨髓細(xì)胞即使在WT細(xì)胞存在的情況下，也很難在胸腺、脾臟和肝臟中重建iNKT細(xì)胞區(qū)室。因此，與同一受體中的CD45.1 iNKT細(xì)胞相比，胸腺、脾臟和肝臟中CD45.2 iNKT細(xì)胞的頻率和絕對數(shù)量都大大減少。這些研究表明USP22以細(xì)胞固有方式調(diào)節(jié)iNKT的發(fā)育。

研究結(jié)論：USP22以細(xì)胞固有方式調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育。

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3.USP22在成熟階段促進(jìn)iNKT的發(fā)展

????????作者推測USP22缺乏會由于CD1d表達(dá)降低而損害iNKT細(xì)胞發(fā)育；然而，在WT和USP22 cKO小鼠之間，CD4+CD8+胸腺細(xì)胞上的細(xì)胞表面CD1d表達(dá)水平相當(dāng)。此外，由于USP22功能對癌細(xì)胞的增殖和存活至關(guān)重要，作者隨后探究USP22基因缺失是否導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加和CD4+CD8+iNKT的生長減少。然而，即使在培養(yǎng)24-72小時后，靶向USP22基因缺失也不會改變膜聯(lián)蛋白V+CD4+CD8+細(xì)胞的百分比。此外，小鼠中USP22缺失未改變BrdU摻入CD4+CD8+DP細(xì)胞。這些結(jié)果在很大程度上排除了USP22通過促進(jìn)iNKT前體的生長或存活來促進(jìn)iNKT細(xì)胞發(fā)育的可能性。USP22 cKO小鼠胸腺中存在一些殘留的iNKT細(xì)胞使作者能夠進(jìn)一步表征iNKT發(fā)育過程中從早期到后期的轉(zhuǎn)變。與WT胸腺相比，其中1%的CD1d四聚體陽性iNKT細(xì)胞處于0期，平均15%的CD1d四聚體陽性iNKT細(xì)胞處于USP22 cKO小鼠胸腺中的0期，并且它們的絕對數(shù)量沒有改變。同樣， CD24loCD44loNK1.1的 1期iNKT細(xì)胞百分比從2.5%增加到20.5%，它們的絕對數(shù)量在WT和USP22 cKO小鼠之間相當(dāng)。重要的是2期iNKT細(xì)胞，它們的絕對數(shù)量下降>80%。進(jìn)一步的分析表明，小鼠中USP22缺失不會改變iNKT細(xì)胞發(fā)育過程中每個發(fā)育階段的BrdU摻入和膜聯(lián)蛋白V+凋亡細(xì)胞。

研究結(jié)論：USP22功能對于從第1階段到第2階段的過渡至關(guān)重要。

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4.USP22功能參與調(diào)節(jié)iNKT但不參與傳統(tǒng)的CD4T細(xì)胞分化

????????接下來，作者分析了USP22缺乏對iNKT分化的影響。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)USP22缺乏導(dǎo)致NTK1和NKT17的百分比顯著降低。相比之下，NKT2細(xì)胞的百分比從15.8%增加到51.3%，表明USP22是NKT1和NKT17分化所必需的，但USP22功能的喪失促進(jìn)了iNKT細(xì)胞向NKT2的分化。為了支持這一觀點(diǎn)，通過細(xì)胞內(nèi)染色對Th1細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的分析證實(shí)了USP22 cKO小鼠中PLZ Flow Tbet+?NKT1細(xì)胞的顯著減少。此外，GATA3的細(xì)胞內(nèi)染色檢測到USP22 cKO小鼠中PLZFhiGATA3+NKT2細(xì)胞顯著增加。與降低的百分比一致，USP22 cKO胸腺中NKT1和NKT17的絕對數(shù)量顯著減少。對譜系特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的進(jìn)一步分析證實(shí)，在USP22缺失小鼠中，產(chǎn)生IFN-γ的iNKT1細(xì)胞顯著減少，產(chǎn)生IL-4的iNKT2細(xì)胞增加。

研究結(jié)論：USP22在特異性重編程iNKT細(xì)胞分化中具有重要作用。

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5.USP22抑制H2A單泛素化以表達(dá)驅(qū)動iNKT發(fā)育的基因? ? ?

????????為了確定USP22如何調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育和功能的分子機(jī)制，作者分析了已被證明對iNKT細(xì)胞發(fā)育、成熟和存活至關(guān)重要的基因的表達(dá)水平。與WT iNKT細(xì)胞相比，實(shí)時RT-PCR分析檢測到USP22 cKO胸腺iNKT細(xì)胞中T-bet和IL-2Rβ的表達(dá)顯著降低。作者還檢測到EGR2和PLZF表達(dá)顯著增加，這兩者都參與促進(jìn)iNKT細(xì)胞發(fā)育的早期階段。作為對照，USP22 cKO iNKT細(xì)胞中USP22的mRNA表達(dá)完全減少，進(jìn)一步證實(shí)了由Lck啟動子驅(qū)動的Cre重組酶有效刪除USP22基因。然后，作者通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)了WT和USP22 cKOiNKT細(xì)胞中T-bet、IL-2Rβ、PLZF和EGR2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。與作者的實(shí)時定量PCR(qPCR)分析一致，與WT細(xì)胞相比，USP22 cKOiNKT細(xì)胞中T-bet和IL-2Rβ的蛋白表達(dá)水平顯著降低。作者還證實(shí)，胸腺iNKT細(xì)胞中PLZF和EGR2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平因USP22缺失而顯著增加?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明USP22可能至少部分通過調(diào)節(jié)T-bet、IL-2Rβ、PLZF和EGR2的表達(dá)來促進(jìn)iNKT細(xì)胞發(fā)育。

????????作為轉(zhuǎn)錄共激活因子組分，USP22經(jīng)常被招募到靶基因的啟動子區(qū)域。然后作者測試了USP22是否與在USP22缺失的iNKT細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生改變的基因的啟動子結(jié)合。事實(shí)上，通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)測定法檢測到USP22與T-bet和IL-2Rβ基因啟動子的結(jié)合。作者隨后使用shRNA介導(dǎo)的敲低方法來敲低DN32.D3細(xì)胞中的USP22表達(dá)。進(jìn)一步分析證實(shí)，USP22抑制導(dǎo)致T-bet和IL-2Rβ顯著減少，但EGR2和PLZF表達(dá)升高，正如作者在原代USP22-nulliNKT細(xì)胞中觀察到的。重要的是，USP22抑制導(dǎo)致T-bet和IL-2Rβ啟動子區(qū)域組蛋白H2A單泛素化水平顯著增加，而不是H2B單泛素化水平，表明USP22促進(jìn)所需基因的表達(dá)通過抑制組蛋白H2A單泛素化來促進(jìn)iNKT的發(fā)展。與作者的發(fā)現(xiàn)類似，USP22不會被PLZF和EGR2啟動子募集，其啟動子上的H2A和H2B單泛素化水平都不會因DN32.D3細(xì)胞中的USP22敲低而改變。

研究結(jié)論：USP22通過抑制組蛋白H2A單泛素化來調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞基因表達(dá)。

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6.USP22與iNKT細(xì)胞中的MED1相互作用

????????作者發(fā)現(xiàn)USP22與MED1相互作用，MED1是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，已被證明對瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的iNKT發(fā)育至關(guān)重要。內(nèi)源性USP22和MED1之間的相互作用在小鼠原代iNKT細(xì)胞中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，因?yàn)樵诳筓SP22免疫沉淀物中檢測到MED1，但在正常兔IgG對照中未檢測到，表明USP22可能部分通過與MED1相互作用的方式調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育。USP22的缺失會阻止iNKT細(xì)胞從第1階段過渡到第2階段，而MED1促進(jìn)iNKT從CD4+CD8+處理器發(fā)展到第0階段過渡。有趣的是，實(shí)時RT-PCR分析表明MED1在iNKT發(fā)育的所有階段都是組成型表達(dá)的。相比之下，USP22表達(dá)在iNKT發(fā)育的早期階段保持在較低水平，并且從第1階段顯著上調(diào)，在第2和第3階段進(jìn)一步增加。作者比較了泛iNKT細(xì)胞中的USP22蛋白表達(dá)與CD4+CD8+細(xì)胞。與作者的實(shí)時RT PCR分析一致，在iNKT細(xì)胞中證實(shí)USP22蛋白表達(dá)增加，但iNKT和CD4+CD8+細(xì)胞之間的MED1表達(dá)水平相當(dāng)。這些結(jié)果解釋了與MED1功能喪失相比，USP22缺陷會在后期損害iNKT發(fā)育的原因。然而，USP22表達(dá)未能抑制MED1泛素化水平。與這一觀察結(jié)果一致，USP22表達(dá)沒有增加MED1蛋白的半衰期。此外，在iNKT細(xì)胞中，USP22敲低不會增加MED1蛋白表達(dá)水平。因此，USP22不太可能通過MED1穩(wěn)定來調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞的發(fā)育。

研究結(jié)論：USP22與iNKT細(xì)胞中的MED1相互作用。

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7.USP22部分通過MED1調(diào)節(jié)驅(qū)動iNKT發(fā)育的基因的表達(dá)? ? ?

????????由于USP22與MED1相互作用，這兩者都是參與促進(jìn)iNKT細(xì)胞中T-bet和IL-2R基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄共激活因子，作者隨后探究MED1是否與USP22依賴的T-bet和IL-2Rβ的啟動子結(jié)合方式。作者生成了MED1敲低DN32.D3細(xì)胞。與USP22敲低DN32.D3細(xì)胞相似，MED1抑制顯著降低了T-bet和IL-2Rβ基因的表達(dá)水平。然而，與USP22敲低不同，MED1抑制不會改變EGR2和PLZF的表達(dá)。這些結(jié)果表明，USP22以MED1依賴性方式促進(jìn)T-bet和IL-2Rβ基因轉(zhuǎn)錄，但它抑制EGR2和PLZF表達(dá)，而不依賴于MED1。值得注意的是，MED1敲低顯著降低了USP22與T-bet和IL-2Rβ啟動子的結(jié)合水平。相比之下，USP22抑制未改變MED1與T-bet和IL-2Rβ啟動子的結(jié)合。這些結(jié)果表明USP22通過MED1相互作用被募集到T-bet和IL-2Rβ啟動子。為了支持這一觀點(diǎn)，作者進(jìn)一步檢測到MED1敲低DN32.D3iNKT細(xì)胞中T-bet和IL-2Rβ啟動子的組蛋白H2A單泛素化水平顯著增加。

研究結(jié)論：USP22部分通過MED1相互作用，調(diào)節(jié)驅(qū)動iNKT發(fā)育的基因的表達(dá)。

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8.Vα14-Jα18 TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以挽救USP22 cKO小鼠的iNKT細(xì)胞缺陷? ? ?

????????已經(jīng)表明，過表達(dá)iNKT細(xì)胞特異性Vα14-Jα18 TCR基因，可以挽救MED1缺失小鼠中iNKT細(xì)胞的發(fā)育缺陷。如果USP22可以通過MED1促進(jìn)iNKT發(fā)育，作者假設(shè)iNKT細(xì)胞特異性Vα14-Jα18 TCR轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)可以挽救USP22 cKO小鼠中的iNKT發(fā)育。因此，作者將USP22 cKO小鼠與在CD4啟動子控制下表達(dá)Vα14-Jα18 TCR基因的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。事實(shí)上，Vα14-Jα18 TCR基因在USP22 cKO小鼠的胸腺、脾臟和肝臟中大大恢復(fù)了iNKT細(xì)胞的相對比例和絕對數(shù)量。Vα14-Jα18 TCR基因表達(dá)導(dǎo)致iNKT細(xì)胞在早期發(fā)育階段積累，在WT和USP22缺失小鼠的胸腺中也檢測到類似的iNKT發(fā)育模式。作者還檢測到USP22-nullVα14-Jα18 TCR轉(zhuǎn)基因iNKT細(xì)胞中T-bet和IL-2Rβ的減少以及PLZF和EGR2的增加說明Vα14-Jα18 TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)在很大程度上挽救了USP22缺陷。

????????基于觀察，作者提出了USP22調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞發(fā)育和功能的模型。USP22通過與另一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子MED1的相互作用被募集到T-bet和IL-2Rβ啟動子。USP22不是去泛素化和穩(wěn)定MED1，而是抑制組蛋白H2A單泛素化以促進(jìn)iNKT發(fā)育所需基因的表達(dá)。因此，USP22基因的靶向缺失在很大程度上通過阻止其從第1階段過渡到第2階段而導(dǎo)致iNKT發(fā)育缺陷。

研究結(jié)論：Vα14-Jα18 TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)在USP22 cKO小鼠中恢復(fù)iNKT細(xì)胞發(fā)育。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的研究確定了遺傳輔因子USP22在iNKT發(fā)育中令人驚訝的譜系特異性功能。USP22部分通過與另一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子MED1的相互作用來促進(jìn)iNKT的發(fā)育。抑制USP22去泛素化酶催化活性的特定抑制劑可能在iNKT介導(dǎo)的免疫疾?。òㄗ陨砻庖呒膊?的治療中具有一定的潛力。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1084/jem.20182218