高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，高效液相色譜儀在醫(yī)藥、食品、飼料、化工、檢測、教學(xué)、環(huán)境等眾多分析領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，很多色譜工作者在操作高效液相色譜儀的過程中出現(xiàn)了各種各樣的問題。作為國內(nèi)較領(lǐng)先的軟件儀器一體化生產(chǎn)的老牌廠家的賽智科技，在服務(wù)客戶的過程中，總結(jié)了客戶在使用高效液相色譜儀的過程中遇到的一些常見問題。

下面就以賽智科技的LC-10T高效液相色譜儀為例，來分享一下高效液相色譜儀在操作過程中遇到的一些常見問題以及解決方法：

一、液相色譜儀液體漏出針管或放空管怎么辦

如果樣品漏出放空管，可能是放空管低于針管，導(dǎo)致虹吸；如果樣品漏出針管，可能是放空管高于針管，導(dǎo)致虹吸?？梢哉{(diào)整放空管，使其出口與針管處于同一水平面。

手柄處于進(jìn)樣位置時(shí)，虹吸現(xiàn)象會(huì)持續(xù)到放空管和針管排空為止。處于取樣位置時(shí)，虹吸現(xiàn)象則會(huì)一直持續(xù)到放空管、針管和定量環(huán)全部都排空為止。若是使用低于進(jìn)樣針的長放空管，會(huì)產(chǎn)生很大的虹吸力，需要特別注意。

用長連接管的原因之一是為了防止來自管道末端的會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶并毒蛇的蒸發(fā)作用。如果液相色譜儀以完全進(jìn)樣方式向定量環(huán)內(nèi)大量進(jìn)樣，在注射器插入之前吸入的空氣會(huì)被排出。但是若以部分進(jìn)樣方式進(jìn)樣，空氣就不會(huì)被完全排出。在這種情況下，為了防止空氣進(jìn)入定量環(huán)，可以再仍處于進(jìn)樣位置時(shí)，即將切換向取樣之前，插入含有下一種樣品的注射器。

這樣可以防止定量環(huán)被虹吸。當(dāng)定量環(huán)由于虹吸而排空，定量環(huán)內(nèi)充滿空氣，當(dāng)手柄切換至進(jìn)樣時(shí)，空氣的存在會(huì)引起系統(tǒng)壓力降低。

二、液相色譜儀中色譜峰為什么分叉

1.色譜柱污染

液相色譜儀在開始時(shí)沒問題，在使用一段時(shí)間后出現(xiàn)這個(gè)問題，可能是由于污染引起的。這時(shí)需要對(duì)色譜柱加強(qiáng)沖洗，即使用比方法流動(dòng)相更強(qiáng)的溶劑沖洗色譜柱。

2.保護(hù)柱失效

如果樣品基質(zhì)比較臟，使用一段時(shí)間之后，發(fā)現(xiàn)的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護(hù)柱失效造成的。一般粗略判斷標(biāo)準(zhǔn)，塔板數(shù)、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護(hù)柱了。

3.接頭連接不正確

如果液相色譜儀色譜柱在使用過程中發(fā)現(xiàn)每個(gè)峰的峰形都出現(xiàn)問題，先考察是否有連接問題。

管線可能太長或太短——這種情況可能導(dǎo)致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當(dāng)，將發(fā)生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會(huì)產(chǎn)生一段死空間，形成混合腔，導(dǎo)致柱外體積，使峰形變壞。

4.溶劑效應(yīng)

在反相LC中， 如使用100%有機(jī)溶劑或100%強(qiáng)溶劑，大體積進(jìn)樣時(shí)，將使液相色譜儀色譜峰過早洗脫出色譜柱，導(dǎo)致峰變形。這時(shí)可以對(duì)分析物進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，從而減少進(jìn)樣體積。或者進(jìn)樣溶劑改為用水稀釋，與流動(dòng)相更為兼容，即使進(jìn)樣體積較大也不會(huì)出現(xiàn)峰變形。

較早流出的峰或靠近溶劑前沿的峰更容易出現(xiàn)拖尾。在液相色譜中用溶于流動(dòng)相的小體積進(jìn)樣最為理想。

5.樣品過載

當(dāng)進(jìn)樣量超過柱子的容量，樣品峰會(huì)呈現(xiàn)分叉或拖尾，解決方案就是減少進(jìn)樣量。這種問題一般在使用小體積色譜柱是表現(xiàn)更為明顯，所以色譜柱方法從常規(guī)250mm或150mm長色譜柱轉(zhuǎn)化到體積較小的快速分析柱時(shí)，進(jìn)樣量要按照柱體積的減小的比例而減小。

6.色譜柱塌陷

液相色譜儀由于柱塌陷引起的峰分叉，很難修復(fù)。如果流動(dòng)相pH>7或在色譜柱pH耐受范圍臨界點(diǎn)附近長時(shí)間使用，是比較容易造成硅膠填料溶解塌陷。如果出現(xiàn)色譜柱塌陷，就會(huì)看到色譜圖中的每個(gè)峰峰形都會(huì)發(fā)生變化(峰拖尾、加寬或分叉)，短時(shí)間內(nèi)可以反方向運(yùn)行，建議直接更換色譜柱。

7.柱前篩板部分堵塞

液相色譜儀長期分析臟樣品，如果沒有保護(hù)柱或在線柱前過濾器，顆粒物和強(qiáng)吸附物很可能在柱入口篩板發(fā)生堵塞，同時(shí)伴隨著壓力升高，解決辦法一般是色譜柱反沖。1.8um粒徑的色譜柱盡量避免反沖，最好在色譜柱前安裝在線過濾器和保護(hù)柱。

8.色譜柱性能下降

色譜柱會(huì)受到其分析的各種目標(biāo)物、使用各種流動(dòng)相并分離不同的樣品基質(zhì)等的影響發(fā)生一些微妙的變化，從而引起峰分叉、拖尾或保留時(shí)間的改變。

在使用新色譜柱時(shí)保留其測試樣品色譜圖非常重要，在使用一段時(shí)間后進(jìn)行比較，就能發(fā)現(xiàn)性能上的變化。如果分離度下降導(dǎo)致不能進(jìn)行良好定量，這根色譜柱就應(yīng)該丟棄并更換了。

三、液相色譜儀分析中柱鈍化的原因

液相色譜儀分析中長時(shí)間連續(xù)地使用柱，填料的組分會(huì)發(fā)生變化。強(qiáng)滯留組分可能被永久性地“鍵合”于填料上，或者填料表面發(fā)生化學(xué)附著，鍵合相可能被部分地去掉，引起保留的變化。

1.污染物的吸附

填料表面積累性地吸附樣品中強(qiáng)保留組分，使填料表面阻塞，所有組分保留減少，塔板數(shù)下降，可以看到柱頭填料變色或稍有損失?？捎脙煞N處置方法：用保護(hù)柱；用強(qiáng)留東西沖洗去掉臟污。用反沖的方法更有效，讓柱放空而不通過檢測池。

2.鍵合相損失

在使用液相色譜儀柱過程中，鍵合相的有機(jī)層會(huì)慢慢損失。應(yīng)避免使用極端的pH值。水和甲醇似乎加速了這種進(jìn)程，因而反相柱鍵合相的損失是一個(gè)特殊問題。

用硅膠保護(hù)柱可減慢鍵合相的損失，盡管有些不方便，但仍有人首選使用。也有人采用在線重新鍵合有機(jī)相方法，但程序比較麻煩，花時(shí)間太多，而且也不一定能恢復(fù)到原來柱的性能。

3.柱過載和介質(zhì)效應(yīng)

柱過載，一般情況是峰拖尾，保留時(shí)間減小，高濃度樣品更嚴(yán)重。減少進(jìn)樣量?？头悠返慕M成有下列情況也可使柱過載，這就是介質(zhì)效應(yīng)。

四、液相色譜儀色譜柱失效的原因

1.篩板堵塞

色譜柱入口篩板堵塞是液相色譜儀最常見的問題之一，會(huì)導(dǎo)致柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問題。通常分析樣品中微粒雜質(zhì)最有可能堵塞色譜柱入口，因此分析時(shí)，需要先過濾或者離心，乳濁或渾濁樣品應(yīng)以0.25μm濾膜處理，也可用針頭過濾器過濾。進(jìn)樣器與泵密封墊的磨損也會(huì)帶入微粒，在進(jìn)樣閥與色譜柱之間使用0.25μm或0.45μm的在線過濾器，通常可以避免這類問題。

2.強(qiáng)保留樣品組分

強(qiáng)吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能嚴(yán)重地影響液相色譜儀色譜柱壽命。像生物組織或體液的提取物、天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品，極易造成柱頭的污染。相對(duì)較純的樣品，一般不會(huì)出現(xiàn)這一問題。色譜柱應(yīng)用中，色譜峰嚴(yán)重拖尾或分裂往往是強(qiáng)保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。

3.色譜柱裝填不良

裝填不良的色譜柱，在短時(shí)間應(yīng)用后，填充床的壓縮通常使柱頭處產(chǎn)生塌陷，導(dǎo)致柱效突然降低。液相色譜儀色譜柱的初始評(píng)價(jià)指標(biāo)，如塔板數(shù)、不對(duì)稱因子等往往不能很好地表征色譜柱床層的穩(wěn)定性，這種情緒只能在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)。

4.壓力因素

液相色譜儀色譜柱使用過程中的驟然壓力波動(dòng)、機(jī)械撞擊或溫度驟然變化都會(huì)對(duì)色譜柱床層產(chǎn)生影響，導(dǎo)致峰形變差和柱效降低。進(jìn)樣過程中，進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動(dòng)太慢可引起壓力波動(dòng)，使色譜柱床產(chǎn)生裂隙，在柱切換時(shí)也存在同樣的問題。使用填充良好的色譜柱，在較低柱壓下操作，可大大減少由壓力波動(dòng)造成的色譜柱損壞。