蛋白質(zhì)和多肽N端的重要生物學(xué)功能

蛋白質(zhì)的合成從N端開始，蛋白質(zhì)N端的序列組成影響蛋白質(zhì)的整體生物學(xué)功能。例如，N端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，并與蛋白質(zhì)亞細(xì)胞器的定位有關(guān)。蛋白質(zhì)的N端測序分析有助于分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)并揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。隨著現(xiàn)代生物制藥工業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)和肽類藥物分子。這些蛋白質(zhì)藥物分子的N端序列的分析和確認(rèn)也是制藥行業(yè)質(zhì)量控制中的重要環(huán)節(jié)。N端區(qū)域也是蛋白質(zhì)和肽的重要結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)可以通過N端的幾個(gè)氨基酸殘基來鑒定。例如，鑒定蛋白質(zhì)和肽類藥物N端的人工修飾位點(diǎn)，如環(huán)化修飾和甲基化修飾，可以為提高其降解穩(wěn)定性和延長功效奠定基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)和多肽的N端測序技術(shù)

Edman降解

埃德曼降解法是一種非常成熟和經(jīng)典的蛋白質(zhì)和多肽N端測序的方法，被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。Edman降解測序的原理主要是指通過循環(huán)反應(yīng)從蛋白質(zhì)的N端一一鑒定氨基酸類型，從而確定蛋白質(zhì)的N端序列。在堿性條件下，異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析肽的N端氨基反應(yīng)，形成苯胺硫代甲酰胺衍生物，然后用酸處理耦合產(chǎn)物。肽鏈的N端被選擇性切割，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。提取的氨基酸衍生物在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的PTH-氨基酸，降解的PTH-氨基酸可以通過HPLC或電泳分析來得到蛋白質(zhì)或肽的N端序列信息。

Edman降解測序的缺點(diǎn)

Edman降解法受到許多限制，例如用于序列分析的蛋白質(zhì)或肽必須具有高純度，不適合用于高通量分析，靈敏度不夠等。

質(zhì)譜N端測序

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)N端序列分析技術(shù)，尤其是電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（MALDI-TOF）技術(shù)的應(yīng)用，質(zhì)譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用發(fā)生了一次革命性的飛躍。高靈敏度、高精度、高分辨率和高通量生物質(zhì)譜技術(shù)為蛋白質(zhì)N端測序提供了一個(gè)重要的選擇，基于質(zhì)譜的N端測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)N端封閉和PEG化蛋白質(zhì)的序列測定，這是對(duì)Edman測序的有效補(bǔ)充。該分析可用于確認(rèn)和鑒定重組蛋白藥物的高級(jí)結(jié)構(gòu)完整性以及重組蛋白N端序列的修飾位點(diǎn)。

化學(xué)標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜

N端序列分析的許多研究方法都結(jié)合使用了質(zhì)譜技術(shù)以及各種化學(xué)方法和生物酶方法，例如，蛋白質(zhì)被側(cè)鏈氨基的還原、烷基化和胍基化封閉。用不同的生物素試劑標(biāo)記游離的N端，用胰蛋白酶消化標(biāo)記的蛋白質(zhì)后，用抗生物素蛋白親和系統(tǒng)分離被標(biāo)記的N端肽，然后通過MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSD MS從頭測序獲得N端肽的序列。

N端測序的未來發(fā)展

隨著經(jīng)典方法、基于質(zhì)譜的各種化學(xué)修飾以及酶輔助技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，蛋白質(zhì)和多肽的N端序列分析獲得了豐富的末端肽序列信息，為加速蛋白質(zhì)藥物高級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定和修飾位點(diǎn)的研究提供了有力的基礎(chǔ)。復(fù)雜生物系統(tǒng)中成千上萬種蛋白質(zhì)的N端序列分析技術(shù)仍然是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于更大規(guī)模地詳細(xì)確定N端修飾多樣性而言，還需要更具針對(duì)性的研究策略。未來的發(fā)展方向可能是探索選擇性更好、修飾更可控的化學(xué)修飾試劑和修飾條件。

參考文獻(xiàn)

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