蛋白質(zhì)測序技術(shù)
1. Edman降解法:Edman降解是肽鏈或蛋白質(zhì)N端氨基酸序列分析技術(shù)之一。蛋白質(zhì)在弱堿性條件下與PITC反應(yīng),然后用酸處理將肽鏈的氨基酸殘基以PTH-AA的形式釋放出來用于序列分析的過程。
優(yōu)點:1. 能夠確定確切的N端氨基酸;2 釋放的氨基酸用色譜法即可進(jìn)行鑒定和定量;3. 可測定混合物中蛋白質(zhì)的N端序列。
缺點:1. 不能測定n端被化學(xué)修飾的序列;2. 遇到非α氨基酸,測序?qū)⑼V梗?. 較大的蛋白質(zhì)不能用Edman降解法進(jìn)行測序;4. Edman降解法一般不能確定二硫鍵的位置。
2. 肽圖譜分析:肽圖譜分析是快速定位蛋白質(zhì)序列的一種有效方法,也是蛋白質(zhì)鑒定中的一種常用方法。該技術(shù)采用質(zhì)譜分析肽,將獲得的圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜庫分析,以獲得氨基酸序列信息。
優(yōu)點:1. 高特異酶消化產(chǎn)生的肽片段大小(m/z)從400到5000不等,對應(yīng) ?4-45個氨基酸殘基,具有足夠的特異性,與常用質(zhì)譜分析儀的掃描范圍一致;2. 結(jié)合特異性和非特異性蛋白酶,實現(xiàn)100%覆蓋任何蛋白質(zhì)or多肽。
缺點:1. 僅測定肽段的質(zhì)量,其它蛋白質(zhì)的污染可能會影響分析的準(zhǔn)確性;2. 只有數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存在的蛋白質(zhì)能被鑒定。
3. 蛋白質(zhì)從頭測序:蛋白質(zhì)從頭測序是一種基于酶裂解肽的方法,肽在質(zhì)譜中表現(xiàn)出規(guī)則的斷裂,從規(guī)則質(zhì)譜峰的質(zhì)量差中獲取氨基酸信息。
優(yōu)點:1. 不需要參考數(shù)據(jù)庫,直接從實驗串聯(lián)質(zhì)譜圖譜推導(dǎo)全長或部分基于標(biāo)簽的肽序列;2. 可鑒定新的多肽、未測序的生物和抗體藥物。
缺點:1. 樣品污染、同位素峰干擾、肽段不完全解離導(dǎo)致的大部分圖譜中重要b-離子峰或y-離子峰丟失;2. n端和c端信息丟失以及各種噪聲干擾。都會導(dǎo)致從頭測序方法準(zhǔn)確性下降,難以獲得正確的肽序列信息。