第九章 DNA的生物合成（復(fù)制）

第一節(jié) DNA的復(fù)制

自從1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和DNA半保留復(fù)制假說(shuō)后，關(guān)于遺傳信息的傳遞，科學(xué)界出現(xiàn)了一場(chǎng)空前熱烈的探索。遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，通過(guò)DNA復(fù)制由親代傳遞給子代；在子代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中又自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種功能，使后代現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。

一、DNA的半保留復(fù)制（semiconservation replication）

1.概念：DNA復(fù)制的一種方式。每條鏈都可作為合成互補(bǔ)鏈的模板，合成出的兩分子雙鏈DNA，每個(gè)分子都是由一條親代鏈和一條新鏈組成。

2.意義：半保留復(fù)制是DNA復(fù)制最重要的特征。這種方式使子代保留了親代DNA的全部遺傳信息，說(shuō)明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)就是遺傳的相對(duì)保守性，體現(xiàn)在代與代之間DNA堿基序列的一致性，或者說(shuō)某種生物的后代只能是它的同種生物而不是其他。

二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式

基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子（replicon）。每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)（origin），可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)（terminus）。

（一）環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制

大腸桿菌DNA復(fù)制始于單一起點(diǎn)或原點(diǎn)（oriC），雙向、等速、對(duì)稱進(jìn)行。在電鏡下復(fù)制的起點(diǎn)與復(fù)制的DNA部分猶如眼睛，稱復(fù)制眼，包括兩個(gè)反向運(yùn)動(dòng)的復(fù)制叉（replication fork），形成θ型。復(fù)制叉移動(dòng)速度約50000 bp/min。染色體完成復(fù)制需要40min。

某些病毒及噬菌體DNA復(fù)制時(shí)，可以觀察到單向滾環(huán)型復(fù)制。在哺乳類動(dòng)物線粒體DNA復(fù)制中發(fā)現(xiàn)，兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條則為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。

（二）線性DNA雙鏈的復(fù)制

真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子。雖然其復(fù)制叉移動(dòng)慢（1000~3000bp/min），但同時(shí)起作用的復(fù)制叉數(shù)目大，DNA復(fù)制的總速度比原核生物還快。

三、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶

DNA指導(dǎo)下的DNA合成，是一個(gè)復(fù)雜、有序的酶促反應(yīng)過(guò)程，涉及幾十種酶和因子參與。

1.DNA聚合酶（polymerase）

2.拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）和解鏈酶（helicase）

環(huán)狀DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)（超螺旋）存在拓?fù)洚悩?gòu)體，“拓?fù)洹币辉~原意是指物體做彈性移位而又保持不變的性質(zhì)。DNA復(fù)制時(shí)必先要解旋和解鏈，拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)DNA分子兼有內(nèi)切酶和連接酶的作用，有Ｉ型和Ⅱ型。前者可切斷雙鏈中的一條鏈，使解旋中不致打結(jié)（適時(shí)又把切口封閉，DNA呈松弛態(tài)，這過(guò)程不耗能）。后者在無(wú)ATP供能時(shí)，可同時(shí)切開(kāi)超螺旋狀態(tài)DNA的兩條鏈，使其松弛，然后將切口封閉（用于分離復(fù)制后的兩個(gè)子環(huán)）。在利用ATP時(shí)，該酶可使松弛態(tài)的DNA變成負(fù)超。

解鏈酶可通過(guò)水解ATP供能來(lái)解開(kāi)雙鏈，每解開(kāi)一對(duì)堿基，需水解2分子ATP。該酶和rep蛋白共同參與解鏈，rep蛋白是沿著前導(dǎo)鏈的模板（母鏈）3′→5′方向移動(dòng)，而解鏈酶按母鏈5′→3′方向移動(dòng)。

3.引物酶（primase）和引發(fā)體

DNA聚合酶沒(méi)有催化兩個(gè)游離dNTP聚合的能力，而RNA聚合酶依靠模板可酶促游離NTP聚合，生成的一段短RNA引物提供3′- OH末端供dNTP加入、延長(zhǎng)。所以，解開(kāi)雙鏈并不是馬上進(jìn)行復(fù)制，先以模板脫氧核苷酸序列，按堿基互補(bǔ)原則合成一小段RNA引物，這一過(guò)程稱“引發(fā)”。引物RNA與模板DNA形成雜交。催化RNA引物合成的RNA聚合酶稱引物酶（或引發(fā)酶）。該酶只有與相關(guān)的蛋白結(jié)合為引發(fā)體才有明顯的活性。引發(fā)體是解鏈酶、DnaC、引物酶和DNA起始復(fù)制區(qū)組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。

4.DNA連接酶（DNAligase）

催化相鄰DNA片段間的連接，即把有缺口的3′- OH末端與相鄰核苷酸5′-磷酸連接形成磷酸二酯鍵，連接反應(yīng)是耗能的。大腸桿菌的DNA連接酶以NAD+為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和某些噬菌體以ATP為能量來(lái)源。這兩個(gè)DNA片段必需與同一個(gè)互補(bǔ)鏈結(jié)合。

5.單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）

一旦DNA雙螺旋解開(kāi)成單鏈，SSB便牢固地結(jié)合到分開(kāi)的單鏈上，防止它們重新形成雙螺旋，保證模板鏈的復(fù)制和不被核酸內(nèi)切酶水解。原核生物的SSB與DNA的結(jié)合表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)SSB結(jié)合后，其后的SSB與DNA的結(jié)合力可提高103倍，且結(jié)合迅速擴(kuò)展，直到全部單鏈DNA都被SSB覆蓋。而真核生物的SSB沒(méi)有此協(xié)同效應(yīng)，也不象DNA聚合酶那樣沿復(fù)制方向向前移動(dòng)，而是不斷地結(jié)合、脫離，直到復(fù)制完成。

6.其他因子

和引發(fā)酶結(jié)合成引發(fā)體的相關(guān)蛋白有6種，priA、priB、priC、、dnaB、dnaC、dnaT。與復(fù)制過(guò)程有關(guān)的起始因子、終止蛋白因子等。

四、DNA半不連續(xù)復(fù)制

DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫星一パa(bǔ)的，而所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5′→ 3′。這很難說(shuō)明DNA在復(fù)制時(shí)兩條鏈同時(shí)作為模板合成新的互補(bǔ)鏈。為了解決這個(gè)矛盾，1968年, 日本學(xué)者岡崎通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究 (3H標(biāo)記的脫氧胸苷的密度梯度離心技術(shù))，提出了半不連續(xù)復(fù)制理論。

五、原核生物DNA的復(fù)制過(guò)程

（一）復(fù)制的起始

這是復(fù)制中較復(fù)雜的環(huán)節(jié)，參與因子較多，是把DNA解成單鏈和生成引物。

E.coli復(fù)制始于單個(gè)位點(diǎn)（oriC），有245bp的序列，一般含兩個(gè)反向重復(fù)單位和三個(gè)串聯(lián)重復(fù)單位。

解鏈?zhǔn)且环N高速的反向旋轉(zhuǎn)，其下游勢(shì)必發(fā)生打結(jié)現(xiàn)象。拓?fù)涿竿ㄟ^(guò)切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接作用，實(shí)現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型，正超螺旋變負(fù)超；DnaA蛋白辯認(rèn)并結(jié)合oriC重復(fù)序列的位點(diǎn)，解鏈酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解開(kāi)雙鏈（DnaC蛋白協(xié)助解鏈）；SSB和引發(fā)酶進(jìn)入，生成的引發(fā)體到達(dá)適當(dāng)位置就可按模板催化NTP的聚合，生成引物，這標(biāo)示復(fù)制起始的完成。后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)復(fù)制的，引發(fā)體需多次生成。

（二）復(fù)制的延長(zhǎng)

DNA-polⅢ在引物的3′-OH端，按模板堿基序，催化加入的dNTPs生成磷酸二酯鍵，子鏈的延長(zhǎng)按5′→3′方向延伸，其速度相當(dāng)快。E.coli基因組，即全套基因染色體上的DNA約3 000kb。按20分鐘繁殖一代，每秒加入的核苷酸數(shù)達(dá)2500bp。隨從鏈先是生成若干短的岡崎片段，片段之間的連接由RNA酶水解去掉引物，留下的空缺（gap）由DNA-polＩ催化填補(bǔ)，再由DNA連接酶將兩個(gè)片段連在一起。

（三）復(fù)制的終止

一般說(shuō)來(lái)，復(fù)制的終止不需要特定的信號(hào)，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)的酶。E.coli環(huán)狀DNA是雙向復(fù)制，起始點(diǎn)和終點(diǎn)剛好把環(huán)分為兩個(gè)半圓，兩個(gè)方向各進(jìn)行180度，復(fù)制至最后的3′-OH末端，可延長(zhǎng)填補(bǔ)起始復(fù)制時(shí)形成的引物所留下的缺口。

六、真核生物DNA的復(fù)制

真核生物基因組比原核生物大得多，其染色體以核小體為結(jié)構(gòu)單位組成，因此DNA的復(fù)制過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜。其特點(diǎn)：

1.有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，可分段復(fù)制。一個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)速度雖比原核生物慢，且不連續(xù)，但利用多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)可加速?gòu)?fù)制，所以總的復(fù)制速度還是快的。

2.真核生物DNA聚合酶有5種，以α、β、γ、δ、ε命名。polα主要催化合成引物，隨從鏈多次合成的引物包含有DNA片段。polδ有解螺旋酶的活性，催化鏈的延長(zhǎng)。β與ε修復(fù)DNA，γ復(fù)制線粒體DNA。

3.端粒復(fù)制

端粒（telomere）是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。形態(tài)學(xué)上，像兩頂帽子蓋在染色體兩端。端粒在維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)制的完整性上有重要作用。

線性DNA復(fù)制終止時(shí)，新鏈最早出現(xiàn)的5′-端引物被降解后，留下的空缺沒(méi)法填補(bǔ)，導(dǎo)致DNA末端有可能縮短。事實(shí)上染色體多次復(fù)制并沒(méi)有變短，這是因?yàn)槎肆Ｓ幸惶鼗腄NA序，富含T、G短序列的多次重復(fù)。端粒酶可催化端粒的復(fù)制。

端粒酶，由三部分組成：端粒酶RNA、端粒酶協(xié)同蛋白和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。

第二節(jié)反轉(zhuǎn)錄

一、反轉(zhuǎn)錄概念和反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）是以RNA為模板，由反轉(zhuǎn)錄酶催化dNTP合成DNA，又稱逆轉(zhuǎn)錄或RNA指導(dǎo)的DNA合成。

第三節(jié) DNA損傷與修復(fù)

DNA復(fù)制的保真性是維持物種相對(duì)穩(wěn)定的主要因素，而DNA復(fù)制時(shí)的錯(cuò)誤是突變（mutation）發(fā)生的原因。突變是生物進(jìn)化和細(xì)胞分化的分子基礎(chǔ)。所以遺傳的穩(wěn)定性和突變的絕對(duì)性組成生物界對(duì)立統(tǒng)一的自然現(xiàn)象。

一、DNA突變和損傷的概念

突變是指DNA分子堿基的改變或表型功能的異常變化。是通過(guò)復(fù)制而遺傳給子代的永久性DNA序列的改變，逃脫或躲過(guò)細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)。DNA損傷通常指DNA序列可修復(fù)的變化（主要是DNA復(fù)制中一條鏈上經(jīng)修復(fù)系統(tǒng)改正的變化）。

突變有自發(fā)和誘發(fā)兩種，其形式有：錯(cuò)配（點(diǎn)突變）、缺失、插入和倒位。

點(diǎn)突變指DNA分子上一個(gè)堿基的改變；缺失指一個(gè)堿基或一段核苷酸序列從DNA分子上消失；插入指一個(gè)或一段原來(lái)沒(méi)有的核苷酸序列插入到DNA分子中間；倒位指DNA鏈內(nèi)較大片段的重組（反置或內(nèi)遷）。

物理因素多見(jiàn)于紫外線照射，引起DNA分子結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)嘧啶二聚體?；瘜W(xué)因素主要有烷化劑、亞硝酸鹽和抗生素及類似物。前兩者引起DNA分子中堿基改變，后者能嵌入DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間，干擾和影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。

二、DNA損傷的修復(fù)

DNA損傷和修復(fù)，是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制中同時(shí)并存的兩個(gè)過(guò)程。修復(fù)（repairing）是針對(duì)已發(fā)生的DNA損傷施行補(bǔ)救，可看作很小范圍內(nèi)的DNA合成。主要有光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù)等。

1.光修復(fù)

2.切除修復(fù)

3.重組修復(fù)

4.SOS修復(fù)