Hello!小薇帶著國自然新熱點擬素化修飾（Neddylation）來嘍！擬素化修飾是近年來發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質翻譯后修飾，可以廣泛地調(diào)節(jié)生物學過程。Cell metabolism上發(fā)表的這篇最新研究中，研究者詳解擬素化修飾調(diào)控葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)的新機制。那么我們要如何get這個新熱點？今天小薇就帶大家一起了解這些問題，一起探索這篇文章研究內(nèi)容及思路。 文獻詳情：

l?題目：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1的擬素化控制葡萄糖代謝 l?雜志：Cell metabolism l?影響因子：IF=29 l?發(fā)表時間：2023年7月

研究背景

葡萄糖是細胞能量的主要來源。在禁食期間，肝臟通過動員內(nèi)部營養(yǎng)儲存和非碳水化合物前體從頭產(chǎn)生葡萄糖（糖異生），在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。這些生理代謝重編程支持身體能量需求，而這種重編程的改變會導致不同病理條件下葡萄糖穩(wěn)態(tài)的異常，如癌癥和糖尿病。 擬素化（Neddylation）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種類似泛素化的蛋白質翻譯后修飾過程，涉及一個三步的酶促過程，可以通過多種方式調(diào)節(jié)蛋白質的活性。但泛素化的作用仍然很大程度上未知。 研究思路

在本篇文章中，作者首先在小鼠體內(nèi)驗證肝擬素化作用受到營養(yǎng)物質利用率的調(diào)節(jié)。接著作者在小鼠中使用四種擬素化損傷模型，發(fā)現(xiàn)擬素化在肝臟維持葡萄糖生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。進一步，作者在四種模型中發(fā)現(xiàn)擬素化缺乏均顯著降低了激素治療的高血糖效應，并評估了擬素化作用的中斷是否會導致胰島素抵抗。同時作者評估了肥胖、血糖正?；騎2D正常的成人（男性和女性）肝臟中的擬素化水平。接著作者通過蛋白質組，鑒定出糖異生的關鍵限制酶PCK1，并進一步揭示PCK1在K278、K342和K387殘基中的擬素化是其體內(nèi)、外糖異生活性所必需的。（ps有問題找小薇，關注小薇，科研熱點、國際前沿or創(chuàng)新型思路，想看啥call下小薇，咱就是說安排?。? 主要結果

01肝擬素化作用受到營養(yǎng)物質利用率的調(diào)節(jié)

首先作者使用禁食24小時的小鼠，發(fā)現(xiàn)NAE1、NEDD8和擬素化的肝cullins（一個由NEDD8擬素化的蛋白家族）的蛋白水平增加；再喂養(yǎng)后下降（圖1A）。進一步觀察到糖食組和瘦素治療組中禁食誘導的肝臟NAE1、NEDD8和擬素化cullins的蛋白水平的的升高被減弱（圖1B,1C）。與此相一致的是，缺乏瘦素受體的小鼠（db/db小鼠）顯示NEDD8和擬素化的cullins水平升高（圖1D）。這些數(shù)據(jù)表明，肝臟擬素化水平通過瘦素受體依賴的機制，因營養(yǎng)缺乏而增加的。

02抑制肝擬素化可以減少葡萄糖的產(chǎn)生

作者在小鼠中使用了四種擬素化損傷模型。與對照組小鼠相比，四種動物模型顯示血糖水平較低，直接反映了糖異生受損（圖1F-1I）。禁食24小時后，所有模型的小鼠的血糖水平都下降（圖1J-1M）。當接受熱量限制（caloric restriction，CR）時，這些模型都沒有一個能夠維持與對照組小鼠相同的血糖水平（圖1N-1Q）。與此一致，與對照組相比，禁食（圖1R）和熱量限制（圖1S）肝臟Nae1敲低小鼠的肝葡萄糖生成（hepatic glucose production，HGP）降低?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明，擬素化在肝臟維持葡萄糖生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。

圖1 擬素化在缺乏營養(yǎng)時被激活，是維持血糖水平的必要條件?

03 肝擬素化調(diào)節(jié)胰高血糖素、腎上腺素和糖皮質激素的糖異生作用

在四種模型中，擬素化缺乏均顯著降低了激素治療的高血糖效應（圖2）。因此，擬素化介導了葡萄糖反調(diào)節(jié)激素的作用，并且是HGP所必需的。

圖2?擬素化是反調(diào)節(jié)激素的糖異生作用所必需的

04肝擬素化與胰島素抵抗相關l

作者用高脂肪飲食（HFD）喂養(yǎng)小鼠短期（4天），損害肝臟胰島素敏感性，刺激了HGP。在所有四種擬素化抑制條件下（如藥理或遺傳），小鼠在HFD治療4天后PTT期間顯示葡萄糖水平降低（圖3A-3D）。這些結果表明，阻斷擬素化可以改善HFD誘導的糖異生。接下來，作者通過在小鼠肝臟（livNAE1小鼠）中過表達NAE1（AAV-DIO-NAE1）進行了功能獲得實驗。這些小鼠與對照組小鼠的體重相同，但丙酮酸轉化為葡萄糖的能力增加，而葡萄糖耐量或胰島素敏感性沒有變化（圖3E-3J）。此外，livNAE1小鼠在禁食24小時期間（圖3K）和急性胰島素治療后（圖3L）也表現(xiàn)出高于對照組小鼠的血糖水平，這表明肝臟中擬素化的激活有利于HGP，并排除了胰島素的降血糖作用。

圖3?抑制擬素化可降低高脂肪飲食誘導的葡萄糖水平

05 2型糖尿病患者肝臟擬素化增加

作者評估了血糖正常肥胖或T2D的患者（男性和女性）肝臟中的擬素化水平。數(shù)據(jù)顯示，與正常血糖肥胖患者相比，T2D組NAE1、NEDD8和擬素化cullins蛋白水平升高（圖4A），以及NAE1和NEDD8蛋白水平與空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量率呈正相關（圖4B和4C）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，肝擬素化的變化與肥胖和T2D患者的高血糖有關。當按性別，數(shù)據(jù)顯示，與肥胖和血糖正常的肥胖女性和男性相比，肥胖和T2D的女性和男性肝臟中NAE1蛋白水平同樣增加（圖4D），擬素化的cullins和NEDD8的蛋白水平均有所升高（圖4D和4E）。

圖4 T2D患者的肝臟中擬素化水平升高

06 糖異生的關鍵限制酶PCK1在營養(yǎng)缺乏時被擬素化

接著，作者使用液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析方法分離了不同亞組的肝擬素化蛋白質組（圖5A）。在210個擬素化蛋白中，只有61個在CR后擬素化水平存在顯著差異。功能富集分析顯示，糖異生的比例過多（圖5B）；例如，糖異生的關鍵限制酶PCK1。與自由喂食的對照組小鼠相比，PCK1在CR喂養(yǎng)的小鼠中富集。同時作者通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)肝臟中PCK1。這些實驗表明，在營養(yǎng)缺乏條件下，NEDD8與PCK1的共沉淀水平升高（圖5C和5D）。PCK1在營養(yǎng)剝奪時擬素化，PCK1和NAE1之間通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)PCK1和NAE1在這些條件下更相關（圖5E和5F）。然后，作者進行了LC-MS/MS分析。通過PCK1肽譜分析發(fā)現(xiàn)，三個PCK1賴氨酸在禁食條件下可能被擬素化：K278、K342和K387（圖5G）。

圖5 PCK1在熱量限制和禁食后在三個賴氨酸中被擬素化

07 PCK1在K278、K342和K387殘基中的擬素化是其體內(nèi)、外糖異生活性所必需的

最后，為了深入了解PCK1擬素化的功能后果，作者將肝細胞在沒有營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后沉默NAE1和NEDD8。禁食細胞的PCK1活性增加；相反，NAE1和NEDD8抑制阻斷了禁食誘導的PCK1活性，同時培養(yǎng)基中的葡萄糖水平降低（圖6A-6C）。這些結果也在體內(nèi)得到了證實。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)以及蛋白質組學和建模，發(fā)現(xiàn)同時突變PCK1的三個賴氨酸殘基（如K278、K342和K387）或單獨突變K387會降低培養(yǎng)基中的PCK1的活性和葡萄糖水平（圖6d和6E）。同樣，通過過表達WT PCK1，而不能通過過表達三個PCK1突變體或單一（K387R）PCK1突變體來恢復活性和葡萄糖生產(chǎn)（圖6D和6E），突出了PCK1賴氨酸殘基的擬素化對PCK1糖異生功能的相關性。PCK1的沉默降低了培養(yǎng)基中PCK1的蛋白水平和活性以及葡萄糖的釋放。PCK1-WT的補充恢復了PCK1的蛋白水平和活性，并持續(xù)增加了培養(yǎng)基中的葡萄糖分泌（圖6G-6I）。三突變體或單突變體的PCK1（K387R）均不能恢復PCK1的活性或葡萄糖水平（圖6J-6O）。同時，作者在小鼠體內(nèi)進一步證實結果。

圖6 擬素化的PCK1是體外糖異生功能所需要的

文章小結 上述研究中，作者描述了擬素化PCK1三個關鍵賴氨酸殘基在葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮生理作用，整體邏輯清晰、環(huán)環(huán)相扣！并結合組學分析探索潛在新靶標及應用價值。該文章對于擬素化的研究思路和實驗設計提供一個方向。感興趣的小伙伴們快來看看吧！ 小薇有話說

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