三陰性乳腺癌（TNBC）約占所有乳腺癌的 15-20%，由于雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2的缺失，患者無法從傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療和HER2靶向治療中獲益。到目前為止，化學(xué)療法仍然是新輔助和輔助環(huán)境中 TNBC 治療的主要選擇。最廣泛使用的化療藥物，如多柔比星 (DOX)，通過誘導(dǎo) DNA 鏈斷裂或 RNA 代謝缺陷發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。然而多柔比星在大多數(shù)患者中最終會(huì)產(chǎn)生化學(xué)抗性，一旦出現(xiàn)化療耐藥，復(fù)發(fā)性疾病會(huì)迅速發(fā)展，這已成為治療 TNBC 的主要障礙。因此，迫切需要確定新的治療靶點(diǎn)以克服 TNBC 的化學(xué)抗性。

環(huán)狀 RNA (circRNA)代表了一種新型的調(diào)控RNA，其特點(diǎn)是具有高度的進(jìn)化保守性和穩(wěn)定性。CircRNA 有望成為各種惡性腫瘤的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，circRNAs在三陰性乳腺癌（TNBC）中的調(diào)控功能和潛在機(jī)制在很大程度上是未知的。

2022年8月29日，山東大學(xué)楊其峰教授團(tuán)隊(duì)在?Journal of hematology and oncology?上發(fā)表題為?CircRNA-CREIT inhibits stress granule assembly and overcomes doxorubicin resistance in TNBC by destabilizing PKR?的研究文章，表明靶向circRNA-CREIT和SGs可以作為治療TNBC化學(xué)耐藥的有效策略。

伯楨生物現(xiàn)已有包含乳腺癌在內(nèi)的超15種腫瘤類器官培養(yǎng)試劑盒，以及為了更好地保護(hù)珍貴的臨床樣本、提高原代組織建成率而研發(fā)的原代組織運(yùn)輸保存液。

首先，研究團(tuán)隊(duì)利用RNA測序分析了六對乳腺癌組織和相鄰正常乳腺組織的circRNA轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)組間有108個(gè)差異表達(dá)的circRNA。其中circRNA-CREIT的表達(dá)在乳腺癌組織和配對的正常組織中表現(xiàn)出最顯著的差異。通過ISH檢測也證實(shí)了乳腺癌組織中circRNA-CREIT的顯著下調(diào)。

接下來，將244名乳腺癌患者分為circRNA-CREIT高表達(dá)組和circRNA-CREIT低表達(dá)組。Kaplan-Meier 繪圖儀證明 circRNA-CREIT 的高表達(dá)與良好的預(yù)后相關(guān)（圖1F）。多變量分析顯示，circRNA-CREIT是乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。此外，較高水平的 circRNA-CREIT 與較低的病理分級、較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和較小的腫瘤大小顯著相關(guān)。然后他們檢測了乳腺癌細(xì)胞系中circRNA-CREIT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) TNBC 中的 circRNA-CREIT 遠(yuǎn)低于非 TNBC 亞型（圖1G）?？偟膩碚f，他們推測circRNA-CREIT可能在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用，特別是在 TNBC 亞型中。

圖1. CircRNA-CREIT 在 TNBC 中被下調(diào)

為了探索circRNA-CREIT在 TNBC 中的潛在作用，他們構(gòu)建了circRNA-CREIT過表達(dá)質(zhì)粒和三種不同的靶向連接區(qū)域的shRNA。首先，他們應(yīng)用RNA-seq篩選 circRNA-CREIT 過表達(dá)細(xì)胞中的差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的基因本體論（GO）分析和基因集富集分析（GSEA）表明，circRNA-CREIT可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞對各種環(huán)境壓力的反應(yīng)密切相關(guān)，尤其是化學(xué)誘導(dǎo)的壓力和細(xì)胞凋亡過程。接下來，他們在實(shí)驗(yàn)中使用DOX。通過進(jìn)行qRT-PCR和ISH檢測，他們發(fā)現(xiàn)circRNA-CREIT在化療耐藥的乳腺癌組織和多柔比星耐藥的TNBC細(xì)胞（MDA-MB-231/DOXR）中顯著下調(diào)。circRNA-CREIT過表達(dá)明顯提高了TNBC細(xì)胞對DOX的化學(xué)敏感性，IC50值顯著降低，而circRNA-CREIT表達(dá)水平降低則相反效果。菌落形成試驗(yàn)的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致。此外，他們發(fā)現(xiàn) circRNA-CREIT 過表達(dá)顯著增強(qiáng)了 DOX 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而 circRNA-CREIT 敲低導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。

圖2. CircRNA-CREIT顯著增強(qiáng)了TNBC細(xì)胞在體外和體內(nèi)的化學(xué)敏感性

為了評估circRNA-CREIT對體內(nèi)腫瘤化學(xué)敏感性的影響，在雌性BALB/c裸鼠中構(gòu)建了腫瘤異種移植模型。結(jié)果表明，在載體對照組和 DOX 處理組中，circRNA-CREIT 過表達(dá)顯著降低了腫瘤生長速率和腫瘤重量（圖2 F-H）。對Ki67和裂解的caspase-3進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以檢測異種移植腫瘤中的增殖率和細(xì)胞凋亡水平。在circRNA-CREIT過表達(dá)組中觀察到增殖減少和細(xì)胞凋亡水平升高，尤其是在 DOX 處理組中。相反，circRNA-CREIT 敲低導(dǎo)致腫瘤生長加速、腫瘤對 DOX 的化學(xué)敏感性降低和細(xì)胞凋亡下調(diào)。

進(jìn)一步，他們構(gòu)建了一個(gè)患者衍生的類器官 (PDO) 模型，以檢測 circRNA-CREIT表達(dá)與PDO 對DOX的敏感性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，具有較高 circRNA-CREIT 表達(dá)水平的PDO往往對DOX更敏感，并且具有較低的IC50值。

圖3. CircRNA-CREIT 與 PKR 物理交互

為了闡明circRNA-CREIT影響化學(xué)敏感性的分子機(jī)制，他們進(jìn)行了RNA pulldown分析，隨后進(jìn)行了電泳、考馬斯藍(lán)染色和質(zhì)譜(MS)。在MS鑒定的蛋白中，PKR被確定為與circRNA-CREIT相互作用的候選蛋白(圖3A)。然后用NPDock表明兩分子之間的物理相互作用(圖3B)。circRNA-CREIT和PKR之間的結(jié)合通過獨(dú)立的RNA pulldown和免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證(圖3C)。并且通過構(gòu)建代表三個(gè)不同莖環(huán)的三個(gè)截短的 circRNA-CREIT 探針，發(fā)現(xiàn)莖環(huán)2可以有效地拉下TNBC細(xì)胞中內(nèi)源性的PKR蛋白。FISH聯(lián)合免疫熒光(IF)檢測顯示內(nèi)源性circRNA-CREIT和PKR在細(xì)胞質(zhì)中共定位，進(jìn)一步驗(yàn)證了circRNA-CREIT和PKR之間的直接相互作用(圖3F)。為了確定PKR的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與circRNA-CREIT的結(jié)合，他們構(gòu)建了截?cái)嗟腜KR突變體(圖3H)。RIP分析表明，在N端缺失 dsRNA 結(jié)合基序（dsRBM1-2）顯著消除了 PKR 和 circRNA-CREIT 之間的相互作用(圖3I)。

圖4. CircRNA-CREIT 通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)促進(jìn) PKR 降解

接下來，他們研究了 circRNA-CREIT 對 PKR 表達(dá)的影響。他們發(fā)現(xiàn)與 circRNA-CREIT 過表達(dá)的影響相反，circRNA-CREIT 敲低增加了PKR蛋白的半衰期。因此，假設(shè) circRNA-CREIT 在 PKR 降解中起重要作用。他們通過蛋白酶體抑制劑 MG132 處理細(xì)胞、co-IP 測定、WB實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circRNA-CREIT通過K48連接的泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo) PKR 降解。并且通過生信分析以及MS結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HACE1參與了 circRNA-CREIT 對 PKR 降解的調(diào)節(jié)作用。

圖5. CircRNA-CREIT 增強(qiáng)了 HACE1 和 PKR 蛋白的結(jié)合

環(huán)狀 RNA 可以通過充當(dāng)該蛋白質(zhì)及其 E3 連接酶的支架來調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)的降解過程。Co-IP分析顯示 HACE1 過表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出增加的 PKR 泛素化，尤其是預(yù)期的 K48 連接的泛素化。并且Co-IP分析證實(shí) circRNA-CREIT 增加了由 HACE1-Myc 沉淀的 PKR-Flag 水平。因此，circRNA-CREIT 作為支架可以將 PKR 和 HACE1 結(jié)合在一起，導(dǎo)致 PKR 降解增加。

圖6. CircRNA-CREIT 通過 PKR/eIF2α 軸減弱 SG 的形成

根據(jù)之前的報(bào)道，PKR 是一種重要的激酶，可在絲氨酸殘基 51 處磷酸化 eIF2α，并觸發(fā)應(yīng)力顆粒 (SGs)的形成。他們檢測了circRNA-CREIT是否通過調(diào)節(jié) PKR 表達(dá)發(fā)揮其作用。他們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA-CREIT的TNBC細(xì)胞表現(xiàn)出比對照細(xì)胞顯著降低的DOX的 IC50 值，并且這種效應(yīng)可以被 PKR 過表達(dá)消除（圖 6A）。此外，他們注意到circRNA-CREIT敲低和PKR 過表達(dá)在提高 TNBC 細(xì)胞中的DOX抗性方面發(fā)揮了協(xié)同作用。菌落形成分析也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，最后得出結(jié)論，PKR介導(dǎo)了circRNA-CREIT對TNBC細(xì)胞化學(xué)敏感性的影響。

考慮到 SGs 在癌癥進(jìn)展中的顯著作用，特別是在增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性方面，他們通過可視化 SG 標(biāo)記蛋白 EIF3A、G3BP1 和 G3BP2，發(fā)現(xiàn) DOX 處理可以有效地觸發(fā) SG 的形成。circRNA-CREIT過表達(dá)減弱了DOX處理下SG的形成，而這種作用被 PKR 過表達(dá)挽救了（圖 6C）。相比之下，circRNA-CREIT 敲除顯著增強(qiáng)了 DOX 誘導(dǎo)和缺氧誘導(dǎo)的SGs的形成。接下來，他們發(fā)現(xiàn)circRNA-CREIT 過表達(dá)顯著降低了eIF2α的磷酸化，而 circRNA-CREIT 敲低促進(jìn)了 TNBC 細(xì)胞中的 eIF2α 磷酸化。DOX 處理以時(shí)間依賴性方式觸發(fā)eIF2α的磷酸化，并且這種效應(yīng)可以通過 circRNA-CREIT 敲低來增強(qiáng)。此外，他們發(fā)現(xiàn)與 MDA-MB-231 細(xì)胞相比，DOX 可以在 DMDA-MB-231/DOXR 中誘導(dǎo)更高的p-eIF2α表達(dá)水平和更多的應(yīng)激顆粒。因此，在TNBC細(xì)胞中DOX抗性與SG形成之間存在密切關(guān)系。

圖7. ISRIB 與 circRNA-CREIT 在提高 TNBC 細(xì)胞的化學(xué)敏感性方面發(fā)揮協(xié)同作用

眾所周知，小分子ISRIB可以有效地逆轉(zhuǎn)eIF2α磷酸化的影響并觸發(fā)SG分解。他們研究表明，circRNA-CREIT過表達(dá)載體和ISRIB的聯(lián)合利用可以發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高TNBC細(xì)胞的藥物敏感性（圖 7A）。另一方面，ISRIB 顯著挽救了由 circRNA-CREIT 敲低引起的化學(xué)抗性（圖 7B）。菌落形成分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果（圖 7 C、D）。使用 DOX 抗性細(xì)胞也證實(shí)了 circRNA-CREIT 和 ISRIB 在逆轉(zhuǎn) DOX 抗性中的協(xié)同作用。為了檢查ISRIB在體內(nèi)化學(xué)抗性中的作用，他們將MDA-MB-231細(xì)胞皮下注射到雌性裸鼠中（圖7E）。單獨(dú)使用 DOX 或單獨(dú)使用 ISRIB 治療可以抑制體內(nèi)腫瘤生長，而 DOX 和 ISRIB 的組合對減弱腫瘤生長具有顯著的協(xié)同作用（圖 7 F、G）。Ki67 和切割的 caspase-3 的 IHC 染色也驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)（圖 7H）。結(jié)果表明，ISRIB是一種有前途的藥物，可與化療聯(lián)合用于治療 TNBC。

圖8. CircRNA-CREIT 通過外泌體傳播在 TNBC 中發(fā)揮腫瘤抑制作用

最近的研究表明，環(huán)狀 RNA 可以被包裝到外泌體中，并通過外泌體將耐藥性傳遞給其他細(xì)胞。首先他們測試了circRNA-CREIT 通過外泌體傳遞發(fā)揮作用的可能性。然后他們使用circRNA-CREIT-外泌體處理的細(xì)胞中，觀察到顯著抑制細(xì)胞增殖和改善對 DOX 的化學(xué)敏感性（圖 8 E、F）。此外，eIF2α的磷酸化水平被 circRNA-CREIT-外泌體下調(diào)，SG形成減弱。circRNA-CREIT-外泌體治療組異種移植腫瘤的生長速度明顯降低，這與 Ki67 和 cleaved caspase-3 的 IHC 染色一致，ISH檢測證實(shí)與對照組相比，circRNA-CREIT 水平更高。此外，乳腺癌患者血漿中 circRNA-CREIT 的表達(dá)水平顯著低于健康人，ROC（接受者操作特征）曲線下面積為 0.72。以上數(shù)據(jù)表明，circRNA-CREIT-外泌體是治療TNBC的有效策略，circRNA-CREIT可以作為乳腺癌診斷的新型生物標(biāo)志物。

總之，他們的研究揭示了 circRNA-CREIT 在調(diào)節(jié)SG形成和 TNBC 化學(xué)抗性中的關(guān)鍵作用。CircRNA-CREIT通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)增強(qiáng) HACE1介導(dǎo)的PKR降解，從而抑制 PKR/eIF2α信號軸和SG形成。此外，circRNA-CREIT 可以通過外泌體傳播并在TNBC細(xì)胞之間傳播化學(xué)敏感性。臨床上，circRNA-CREIT 在乳腺癌患者的 TNBC 組織和血漿中顯著下調(diào)，且 circRNA-CREIT的高表達(dá)與良好的預(yù)后密切相關(guān)。此外，circRNA-CREIT的生物合成被DHX9 下調(diào)?？傊?，研究表明，circRNA-CREIT是乳腺癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。靶向 circRNA-CREIT和SG形成可能是增強(qiáng) TNBC 化學(xué)敏感性的有效策略。