哈嘍，艾瑞巴蒂！今天碎碎帶來(lái)了活體轉(zhuǎn)染第六彈，給大家淺談一下活體轉(zhuǎn)染試劑在癌癥啟動(dòng)子特異性選擇中的應(yīng)用。

本次選取的這篇文章發(fā)表在Cancers，題為-Conversion of a Non-Cancer-Selective Promoter into a Cancer-Selective Promoter。?

此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)一種特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的遺傳工具，可以通過(guò)在大鼠pGADD(GADD34最小啟動(dòng)子)中引入特定的點(diǎn)突變將這種非癌癥特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化為癌癥選擇性啟動(dòng)子, 并且添加GATA2和現(xiàn)有的AP1和PEA3轉(zhuǎn)錄因子將進(jìn)一步增強(qiáng)了GAPE-Prom的癌癥選擇性活性。GAPE-Prom提供了一種特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的遺傳工具。

背景:

PEG3是一種廣譜的腫瘤特異性基因,在人癌細(xì)胞系中明顯高表達(dá),而在正常組織細(xì)胞中極少表達(dá)，它的啟動(dòng)子表現(xiàn)出癌癥選擇性表達(dá)，允許轉(zhuǎn)基因的癌癥定向調(diào)節(jié)，病毒復(fù)制和動(dòng)物腫瘤和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)成像。而GADD34的過(guò)表達(dá)抑制生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，它的啟動(dòng)子缺少癌癥特異性。但是PEG-3和GADD34的最小啟動(dòng)子具有強(qiáng)烈的序列同源性，除了兩個(gè)單點(diǎn)突變。本文探索了改變這兩種核苷酸在決定癌癥選擇性基因表達(dá)中的相關(guān)性。

接著我們具體看看文章中活體轉(zhuǎn)染的應(yīng)用思路吧

首先為了確定為什么pPEG（PEG34最小啟動(dòng)子）與pGADD的功能差異，比較了二者序列，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同的堿基對(duì)，后對(duì)pGADD進(jìn)行定點(diǎn)突變，轉(zhuǎn)化為pPEG，稱pGAPE。后將啟動(dòng)子克隆到載體上后轉(zhuǎn)化進(jìn)人的癌細(xì)胞，原代細(xì)胞，以及正常的永生細(xì)胞中，進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。

結(jié)果表明pGAPE與pPEG在癌細(xì)胞中表現(xiàn)出類似的高表達(dá)。而在上的所有細(xì)胞系中，?pGADD活性沒有顯著變化(Fig 1)。

接著，作者驗(yàn)證了腫瘤動(dòng)物體內(nèi)pPEG和pGAPE啟動(dòng)子的癌癥特異性。使用in?vivo jetPEI 進(jìn)進(jìn)行不同啟動(dòng)子的傳遞和成像。在這里，作者選取雄性無(wú)胸腺裸鼠，進(jìn)行全身給藥。40 μg DNA 和 4.8 μL in vivo jetPEI 分別稀釋在不含內(nèi)毒素的 5% (wt/vol) 葡萄糖中，混合，配置成400ul注射液。單次 200 μL 注射液以 5分鐘的間隔靜脈注射兩次。注射后48h進(jìn)行活體成像觀察。這里，作者特意選取in vivo jetPEI而非病毒遞送，來(lái)避免有偏好的全身遞送。

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結(jié)果表明，在所有的模型中，當(dāng)由pPEG或pGAPE驅(qū)動(dòng)時(shí)，可以通過(guò)BLI特異性地在腫瘤中檢測(cè)到熒光素酶，而由pGADD驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性對(duì)腫瘤不具有特異性。

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最后，作者總結(jié)兩點(diǎn)突變對(duì)于將非癌癥特異性pGADD轉(zhuǎn)化為癌癥選擇性pGAPE至關(guān)重要，這種新設(shè)計(jì)的pGAPE體現(xiàn)了所有必要的功能，使其成為以癌癥選擇性方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的理想工具，既可以無(wú)創(chuàng)地提供成像劑以跟蹤腫瘤促進(jìn)和轉(zhuǎn)移，又可以創(chuàng)建表達(dá)癌癥中獨(dú)特復(fù)制功能的CRAD。

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