本文介紹了應(yīng)用鱟試劑（LAL）或重組C因子（rFC）進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET）的分析標(biāo)準(zhǔn)，用于藥物和醫(yī)療器械提取物等水溶液中內(nèi)毒素的生物活性測定。它解釋了這些標(biāo)準(zhǔn)對準(zhǔn)確分析的重要性，從而可以推動更健全的BET，保護患者免受內(nèi)毒素的影響。

部分凝膠法鱟試驗中，BET是純定量的，也就是說，內(nèi)毒素的活性以內(nèi)毒素單位EU表示，也可表示為國際單位IU。由于對液體進行分析，通常將內(nèi)毒素的活性轉(zhuǎn)換為濃度（如EU/mL），進而轉(zhuǎn)換為其他測量單位（如EU/mg）。不同的BET方法遵循a）藥典標(biāo)準(zhǔn)和b）由試劑制造商制定的試驗標(biāo)準(zhǔn)；旨在保證更健全的測試性能標(biāo)準(zhǔn)。

藥典標(biāo)準(zhǔn)

統(tǒng)一的BET章節(jié)（USP <85>，歐洲藥典2.6.14.，日本藥典4.01）和即將發(fā)布使用rFC的BET章節(jié)（歐洲藥典2.6.32）涉及相關(guān)限（線性）、回收率（準(zhǔn)確度）和陰性對照。在定量BET中，內(nèi)毒素活性與信號輸出之間存在明顯的相關(guān)性。從0到無窮大EU/mL的整個范圍可以用一個乙狀模型來描述，如四參數(shù)邏輯回歸（4PL；圖1）。

如果范圍受到限制，則可以通過信號輸出對數(shù)和內(nèi)毒素活性之間的線性回歸來擬合數(shù)據(jù)，并有可能通過先前的信號消隱來向下擴展。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的所需范圍，可以使用任何一種回歸模型。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的所需范圍，可以使用任一回歸模型。另一方面，與標(biāo)準(zhǔn)曲線點相同參數(shù)的多項式模型呈現(xiàn)過擬合，也就是說，它強制曲線通過點而不考慮潛在關(guān)系。因此，在移液和測量中可能發(fā)生的隨機誤差沒有得到補償。

如果標(biāo)準(zhǔn)曲線穿過所有標(biāo)準(zhǔn)點，則存在完全相關(guān)，返回為相關(guān)系數(shù)的絕對值|r|是1。然而，系統(tǒng)誤差（例如不完全遵循線性回歸的相關(guān)性和隨機誤差）通常會導(dǎo)致偏離這種完美相關(guān)性，由較低的|r|表示。這反過來會導(dǎo)致BET準(zhǔn)確性降低。因此，|r|的下限設(shè)定為 0.980。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線是計算所有內(nèi)毒素濃度的基礎(chǔ)，因此其可靠性至關(guān)重要。

藥典中提到的第二個數(shù)值限制也旨在確保高準(zhǔn)確性。鑒于許多化合物會干擾BET（即增強/抑制測定，從而扭曲測量的內(nèi)毒素活性），因此使用陽性產(chǎn)品對照（PPC）。它們代表摻入規(guī)定量內(nèi)毒素的樣品溶液的等分試樣，通常是為了在接近測量范圍中心的地方實現(xiàn)內(nèi)毒素活性。未加標(biāo)樣品中PPC中因相應(yīng)活性而降低的內(nèi)毒素活性必須在加標(biāo)預(yù)期活性的50%至200%以內(nèi)。稀釋是從干擾樣品中獲得這種有效加標(biāo)回收率的最常見方法。盡管如此，還有許多其他方法可以克服干擾，例如pH中和、過濾、離心、提取、內(nèi)毒素固定化，加熱和補充鎂、Tris-HCl緩沖液或螯合劑。

與上述線性和準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)相比，陰性對照品的限度只作了模糊的描述：它不得超過試劑制造商所描述的空白限度。這意味著空白必須在試劑制造商設(shè)定的范圍內(nèi)返回信號輸出。根據(jù)試劑、儀器和目標(biāo)信號輸出的不同，這些限制可能會有很大差異；也就是說，在信號輸出水平上沒有任何普遍適用的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)。充其量可以定義為，內(nèi)毒素最低標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素活性一定不能達到或超過空白。然而，這不會揭示同樣影響標(biāo)準(zhǔn)和空白的污染，例如，在試劑被污染的情況下，污染的活性同樣被添加到所有其他污染中。

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與測試相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)

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除藥典標(biāo)準(zhǔn)外，BET試劑制造商還實施了一些標(biāo)準(zhǔn)，以確保內(nèi)毒素活性測定的準(zhǔn)確性。

每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、PPC和空白至少一式兩份進行分析，并報告其平均內(nèi)毒素活性。重復(fù)之間的強烈偏差，即低精度，表明其中至少有一個不能準(zhǔn)確返回活性。通常情況下，BET精密度使用變異系數(shù)（CV，也稱為相對標(biāo)準(zhǔn)差，RSD）進行量化，該系數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值。事實上，CV可以根據(jù)BET中出現(xiàn)的幾個單位進行計算，最常見的是原始或中間數(shù)據(jù)，例如開始時間。盡管如此，這種選擇是基于這樣的假設(shè)，即重復(fù)僅在信號輸出方面有所不同，而在內(nèi)毒素活性方面沒有差異?；蛘?，CV可以在內(nèi)毒素濃度上計算，用來另外表示這種活性差異，例如，由于不可避免的移液誤差。

有趣的是（圖2），25%的CV（EU/mL）實際上可能比10%的CV（起始時間）更精確。同樣，許多其他因素也會影響B(tài)ET中的CV，如測量誤差、移液延遲、溫度、樣品和試劑的異質(zhì)性以及氣泡和顆粒的存在。因此，材料、方法和人員的同質(zhì)性是關(guān)鍵。

定性常涉及標(biāo)準(zhǔn)曲線的排他性生成。除了|r|，試劑制造商還對標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)（如線性曲線的斜率和y截距）或其他特定于不同回歸模型的參數(shù)施加限制。無效斜率可能表明（系統(tǒng)性）移液錯誤、污染或內(nèi)毒素吸附。除了后兩者之外，試劑劣化或不合適的儀器設(shè)置也可能導(dǎo)致無效的y截距（漸近線在4PL）。

結(jié)論

本研究建立的BET標(biāo)準(zhǔn)有助于準(zhǔn)確定量內(nèi)毒素。了解基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的生成、數(shù)學(xué)基礎(chǔ)和影響因素，可以優(yōu)化方法并可靠地滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。這樣，患者的安全仍有保障。