免疫檢查點(diǎn)抑制劑引起的心臟毒性是最致命的不良反應(yīng)之一，因此，潛在機(jī)制的研究對于制定治療策略具有重要的臨床意義。2022年1月，武漢大學(xué)人民醫(yī)院楊靜和周曉陽教授的研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research期刊（IF:11.161）上發(fā)表了題為“Prevotellaceae produces butyrate to alleviate PD-1/PD-L1 inhibitor-related cardiotoxicity via PPARα-CYP4X1 axis in colonic macrophages”的研究論文，旨在研究微生物與宿主的相互作用是否有助于緩解PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性。文章中的16S?rRNA微生物多樣性檢測服務(wù)由歐易生物提供技術(shù)支持。

?研究背景?

靶向程序性細(xì)胞死亡1(PD-1)或其配體1(PD-L1)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在抗腫瘤治療中具有重要的臨床意義，但會(huì)引起致命的免疫不良反應(yīng)——心臟毒性。為了克服這一不良反應(yīng)，必須盡量減少全身炎癥。改變腸道微生物群落在心血管疾病的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。腸道微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)，如丁酸，具有抗炎特性。然而，控制腸道菌群及其代謝產(chǎn)物，是否能阻止PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性尚不清楚。

巨噬細(xì)胞是自身免疫和自身炎癥疾病中炎癥介質(zhì)的主要生產(chǎn)者。前期研究表明，抑制細(xì)胞色素P450 (CYP) 4X1【CYP4X1】使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞重新分化為M1表型，并上調(diào)M1樣因子TNF-α和IL-1β。然而，CYP4X1和結(jié)腸巨噬細(xì)胞衍生的M1樣因子TNF-α和IL-1β是否與PD-1/PD-L1抑制劑相關(guān)的心臟毒性有關(guān)尚不清楚。

?研究內(nèi)容?

在本研究中，首次提供了PD-1/PD-L1抑制劑以腸道微生物群依賴的方式誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性的直接證據(jù)。P.loescheii定植和補(bǔ)充丁酸對PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性有保護(hù)作用。此外，還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)可上調(diào)結(jié)腸巨噬細(xì)胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)。這是首次證實(shí)腸道微生物群和結(jié)腸巨噬細(xì)胞在PD-1/PD-L1抑制劑引起心臟毒性中的相互作用。

?研究結(jié)果?

1.?BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性

PD-1/PD-L1抑制劑BMS-1(5和10 mg/kg)處理的小鼠的食物攝入量與對照組相比呈現(xiàn)下降趨勢，但三組之間沒有顯著差異(圖1A)。BMS-1(5和10 mg/kg)降低了小鼠的體重，但增加了心臟/體重的比值(圖1B)。腦鈉肽(BNP)是心臟功能失常的指標(biāo)，BMS-1 (10 mg/kg)顯著提高了BNP水平(圖1C)。BMS-1處理小鼠外周血中CK-MB、AST、CK和LDH等心肌酶活性也得到了類似的結(jié)果(圖1D)。此外，BMS-1 (10 mg/kg)顯著降低了抗凋亡蛋白HAX-1和Bcl-2的水平，但增加了促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的水平(圖1E)。與對照組相比，BMS-1(5和10 mg/kg)也增加了心肌組織中的炎癥浸潤、間質(zhì)纖維化和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)陽性心肌細(xì)胞的數(shù)量(圖1F-H)。BMS-1(5和10 mg/kg)抑制黑色素瘤的生長，可以通過降低腫瘤重量和熒光素酶強(qiáng)度來證明(圖1I和J)。這些結(jié)果表明，PD-1/ PD-L1抑制劑BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性。

圖1?BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性

2.?BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠腸道黏膜屏障損傷

腸屏障功能障礙包括機(jī)械屏障(腸黏膜上皮)和生物屏障(腸道微生物群)損傷導(dǎo)致心功能受損。對結(jié)腸黏膜完整性進(jìn)行評估。如圖2所示，BMS-1(5和10 mg/kg)降低了結(jié)腸組織絨毛高度和杯狀細(xì)胞數(shù)量，并下調(diào)了緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)。測定腸系膜灌注評分，發(fā)現(xiàn)BMS-1(5和10 mg/kg)降低了腸系膜灌注(圖2E)。這些結(jié)果表明BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠腸道黏膜屏障損傷。

圖2?BMS-1誘導(dǎo)黑色素瘤小鼠腸道屏障損傷

3.?腸道微生物菌群失調(diào)有助于PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性

對糞便中的細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行測序，以評估腸道生物屏障。雖然BMS-1(5和10 mg/kg)對糞便總菌量或種類沒有顯著影響(圖3A)，但beta分析顯示腸道菌群構(gòu)成存在明顯差異，尤其是BMS-1 (10 mg/kg)組與對照組之間(圖3B)。alpha多樣性分析也表明，Shannon指數(shù)降低，但不影響Chao指數(shù)和Sobs指數(shù)(圖3C和D)。圖3E顯示BMS-1顯著改變了菌門的豐度。厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的比值(腸道失調(diào)的標(biāo)志)在BMS-1作用下顯著增加(5和10 mg/kg)(圖3F)。通過LEfSe分析確定差異表達(dá)菌(圖3G)。在門水平，BMS-1(5和10 mg/kg)處理顯著降低了擬桿菌屬的豐度。相反，與對照組相比，BMS-1 (10 mg/kg)處理小鼠的厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)的豐度顯著增加。

在屬水平上，與對照組相比，在BMS-1 (10 mg/kg)處理的小鼠中觀察到Prevotellaceae和Rikenellaceae屬的缺失和Escherichia-Shigella的富集。與對照組相比，BMS-1 (5 mg/kg)處理的小鼠Ruminococcaceae屬的豐度顯著增加，BMS-1 (10 mg/kg)與對照組之間沒有顯著差異(圖3H)。為了探究腸道菌群在BMS-1誘導(dǎo)的心臟毒性中的作用，進(jìn)行了糞菌移植（FMT）實(shí)驗(yàn)，用BMS-1 (5,10 mg/kg)處理的小鼠的腸道菌群進(jìn)行了腸道菌群的重建(圖3I)。令人意外的是，BMS-1處理的小鼠FMT顯著誘導(dǎo)了心肌酶(CK-MB、AST、CK和LDH)的泄露和心肌細(xì)胞的凋亡(圖3J和K)。結(jié)果表明，腸道微生物菌群失調(diào)有助于PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性。

圖3?腸道微生物失調(diào)導(dǎo)致PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性

4.?P.loescheii定植和補(bǔ)充丁酸鹽可減輕 PD-1/PD-L1 抑制劑引起的心臟毒性

通過KEGG通路分析，檢測腸道菌群中功能基因的相對豐度。與對照組相比，BMS-1 (10 mg/kg)處理的小鼠的脂肪酸合成途徑顯著下調(diào)(圖4A)。測定了BMS-1和對照組小鼠的糞便中SCFAs，發(fā)現(xiàn)BMS-1(5和10 mg/kg)顯著降低了丁酸水平，而乙酸、丙酸、戊酸和己酸保持不變(圖4B)。向BMS-1 (10 mg/kg)處理的小鼠提供P.loescheii或丁酸(圖4C)，糞便中P.loescheii(圖4D)和丁酸鹽水平的增加證實(shí)了P.loescheii定植的有效性(圖4E)。P.loescheii定殖和添加丁酸鹽可減弱BMS -1誘導(dǎo)的心肌酶泄露和心肌細(xì)胞凋亡(圖4F和G)。這些數(shù)據(jù)表明，P.loescheii定殖和添加丁酸鹽可減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性。

圖4?P.loescheii定植及補(bǔ)充丁酸可減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性

5.?M1樣結(jié)腸巨噬細(xì)胞及其因子IL-1β和TNF-α有助于減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性

BMS-1(5和10 mg/kg)顯著增加了M1樣(CD68+iNOS+)細(xì)胞的數(shù)量，上調(diào)了M1基因(iNOS和CXCL9)，但降低了M2樣(CD68+CD206+)細(xì)胞的數(shù)量和下調(diào)了M2基因(CD206和Arg-1)(圖5A-D)。此外，BMS-1顯著提高了結(jié)腸巨噬細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的水平，但沒有提高TGF-β和IL-10的水平(圖5E)。為了確定BMS-1是否通過改變結(jié)腸巨噬細(xì)胞表型誘導(dǎo)心臟毒性，用抗CSF-1抗體(IgG作為對照)清除結(jié)腸巨噬細(xì)胞(圖5F)。如圖5G和H所示，抗CSF-1抗體顯著降低了BMS-1 (10 mg/kg)處理小鼠外周血心肌酶(CK、LDH、CK-MB和AST)水平和心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。用IL-1β和TNF-α抗體來阻斷它們的作用(圖5I)，發(fā)現(xiàn)抗IL-1β或抗TNF-α抗體部分消除了BMS-1誘導(dǎo)的心臟毒性。重要的是，IL-1β和TNF-α聯(lián)合阻斷比單獨(dú)阻斷更能減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性(圖5J和K)。結(jié)果表明，結(jié)腸巨噬細(xì)胞來源的M1樣因子IL-1β和TNF-α有助于減輕PD-1/PD-L1抑制劑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心臟毒性。

圖5?M1樣結(jié)腸巨噬細(xì)胞及其因子IL-1、β和TNF-α有助于減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性

6.?P.loescheii定植以及添加丁酸可下調(diào)結(jié)腸巨噬細(xì)胞IL-1β和TNF–α

P.loescheii定殖和丁酸的補(bǔ)充抑制了BMS-1誘導(dǎo)的結(jié)腸組織中M1樣(CD68+iNOS+)細(xì)胞數(shù)量的增加和M2樣(CD68+CD206+)細(xì)胞數(shù)量的減少(圖6A)。P.loescheii定殖和添加丁酸可下調(diào)M1基因(iNOS和CXCL9)的mRNA表達(dá)，但上調(diào)M2基因(CD206和Arg-1)的表達(dá)(圖6B)。還觀察到結(jié)腸巨噬細(xì)胞M1樣因子(IL-1β和TNF-α)和M2樣因子(TGF-β和IL-10)水平的類似改變(圖6C)。結(jié)果表明在PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性反應(yīng)中，P.loescheii定植和丁酸可以阻止結(jié)腸巨噬細(xì)胞M1樣極化和促炎因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。

圖6?P.loescheii定植及補(bǔ)充丁酸下調(diào)結(jié)腸巨噬細(xì)胞IL-1β和TNF-α的表達(dá)

7.?丁酸通過PPARα激活阻止NF-κB介導(dǎo)的M1樣極化和心肌細(xì)胞凋亡

研究發(fā)現(xiàn)BMS-1(5和10 mg/kg)顯著降低了結(jié)腸巨噬細(xì)胞PPARα的表達(dá)(圖7A)。為了檢測PPARα在結(jié)腸巨噬細(xì)胞極化和心肌細(xì)胞凋亡中的作用，通過western blot和qPCR檢測GW6471抑制PPARα表達(dá)的效果(圖7B)。圖7C-F所示，丁酸能抑制LPS誘導(dǎo)的PNMS和RAW264.7細(xì)胞中p-p65、TNF-α和IL-1β的上調(diào)，并能減少TUNEL陽性的HL-1心肌細(xì)胞的數(shù)量。而PPARα拮抗劑GW6471則破壞了丁酸的保護(hù)作用。PPARα siRNA沉默實(shí)驗(yàn)的類似結(jié)果證實(shí)，丁酸可以通過PPARα依賴的方式阻止LPS誘導(dǎo)的M1樣極化和心肌細(xì)胞凋亡(圖8A-F)。此外,發(fā)現(xiàn)抗IL-1β或抗TNF-α抗體部分消除了LPS誘導(dǎo)的心臟毒性。心肌酶水平下降，TUNEL陽性心肌細(xì)胞數(shù)量減少。重要的是，IL-1β和TNF-α聯(lián)合阻斷比單獨(dú)阻斷效果更好(圖8G-I)。這些結(jié)果表明，丁酸通過PPARα的激活，阻止NF-κB介導(dǎo)的M1樣極化和心肌細(xì)胞凋亡。

圖7?丁酸鹽通過激活PPARα阻止NF-kB介導(dǎo)的M1樣極化和心肌細(xì)胞凋亡

?圖8?丁酸鹽通過激活PPARα阻止NF-kB介導(dǎo)的M1樣極化和心肌細(xì)胞凋亡

8.?通過PD-1/PD-L1抑制劑下調(diào)CYP4X1可使PPARα失活，并在結(jié)腸巨噬細(xì)胞中形成正反饋環(huán)

檢測了CYP4X1在結(jié)腸巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。如圖9A所示，BMS-1(5和10 mg/kg)顯著降低了結(jié)腸巨噬細(xì)胞CYP4X1的表達(dá)。與對照組相比，BMS-1(5和10 mg/kg)處理的小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞中來自CYP4X1的14,15-EET-EA的催化產(chǎn)量顯著降低(圖9B)。用BMS-1(10 mg/kg)處理WT和Cyp4x1?/?小鼠，圖9C和D所示，與WT小鼠相比，Cyp4x1?/?小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞中14,15-EET-EA產(chǎn)量減少，TNF-α和IL-1β的分泌增加。此外，在Cyp4x1?/?小鼠中觀察到更多TUNEL陽性的心肌細(xì)胞和更高水平的血清心肌酶(CK、LDH、CK-MB和AST)(圖9E和F)。PPARα siRNA下調(diào)了CYP4X1，反過來，CYP4X1敲除又下調(diào)了結(jié)腸巨噬細(xì)胞中PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)(圖9G)。外源性添加14,15-EET-EA顯著降低PNMS中PPARα的表達(dá)，增加IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，從而逆轉(zhuǎn)BMS-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(圖9H-K)。這些結(jié)果表明，PD-1/PD-L1抑制劑下調(diào)CYP4X1可使PPARα失活，并在結(jié)腸巨噬細(xì)胞中形成正反饋環(huán)。

圖9?PD-1/PD-L1抑制劑下調(diào)CYP4X1使結(jié)腸巨噬細(xì)胞PPARα失活并形成正反饋環(huán)

?研究結(jié)論?

本研究表明，腸道菌群失調(diào)通過下調(diào)結(jié)腸巨噬細(xì)胞PPARα-CYP4X1軸，誘導(dǎo)產(chǎn)生的少量丁酸有助于減輕PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性。研究確認(rèn)了腸道微生物群和結(jié)腸巨噬細(xì)胞之間在PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性中的交流。提出了一種新的PD-1/PD-L1抑制劑相關(guān)心臟毒性的作用機(jī)制，并為通過控制腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物丁酸酯使免疫治療更安全、更有效提供了一個(gè)值得關(guān)注的靶點(diǎn)。

圖10 P.loescheii通過上調(diào)結(jié)腸巨噬細(xì)胞PPARα-CYP4X1軸產(chǎn)生丁酸來緩解PD-1/PD-L1抑制劑引起的心臟毒性?

?原文鏈接?

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-02201-4 ?

歐易生物秉持著“以生物科技，成就他人，造福大眾”的理念。為眾多方向的研究學(xué)者提供持久可靠的科研助力。想要了解更多產(chǎn)品信息可撥打400-808-5350?或咨詢駐地工程師，歡迎老師前來公司參觀哦~

END

Vivilla? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

轉(zhuǎn)載請注明文本轉(zhuǎn)自歐易生物