MDA-MB-231細胞系是從一名51歲的白種女性轉移性乳腺癌的胸腔積液建立的人乳腺細胞系。該上皮細胞系是醫(yī)學研究實驗室中使用最廣泛的乳腺癌細胞系之一，特別是涉及CRISPR/Cas9基因敲除和基因敲除的那些。

由于缺乏ER和PR表達以及HER2擴增，該細胞系最初被歸類為“基礎”乳腺癌細胞系。然而，由于它表現(xiàn)出claudin-3和claudinin-4的下調，Ki-67增殖標記物的低表達，與上皮-間質轉化有關的標記物的富集，因此現(xiàn)在被認為屬于claudin-低分子亞型。以及與乳腺癌干細胞（CSC）相關的特征的表達，例如CD44 + CD24- /低表型。這就是為什么許多研究一直專注于基因編輯MDA-MB-231細胞系的原因。

應用：

?1. CRISPR / Cas9誘變使靶向MDA-MB-231細胞的推定癌癥依賴性無效。

?癌細胞需要表達某些基因的表達，這些基因編碼腫瘤生長所必需的蛋白質。沉默這些基因的表達或阻斷蛋白質的活性可以觸發(fā)細胞死亡和持久的腫瘤消退。因此，識別和表征癌癥依賴性是臨床前癌癥研究的關鍵目標。 MELK被認為是多種癌癥類型的癌癥依賴性和推定藥物靶標，其中之一是MDA-MB-231細胞系。 MELK在乳腺癌細胞中過表達，與患者預后不良有關。此外，據(jù)報道，使用RNAi敲低MDA-MB-231細胞中的MELK可阻止癌細胞增殖并觸發(fā)細胞周期停滯或有絲分裂災難。

?研究人員設計了針對MELK的七個指導RNA（gRNA），并將每個指導RNA克隆到一個表達GFP的載體中，并將該指南轉導到了三個表達Cas9細胞系中：三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231據(jù)報道會上癮。 MELK表達。對過表達的MDA-MB-231細胞中MELK蛋白水平的蛋白質印跡分析證實，CRISPR系統(tǒng)可有效消除MELK表達。

2.β1整合素對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖和細胞信號傳導的不同影響

?為了探索β1整合素的功能意義，研究人員通過基于CRISPR/Cas9的方法建立了β1-KOMDA-MB-231細胞。進行蛋白質的印跡和FACS分析以確認MDA-MB-231細胞系中β1的有效敲除。令人驚訝地，β1的表達對細胞增殖表現(xiàn)出相反的作用。這些效應取決于細胞密度，當在稀疏條件下培養(yǎng)細胞時，它們顯示出細胞增殖的上調，而在稠密條件下，則表明細胞生長的下調。與野生型細胞相比，KO MDA-MB-231細胞中ERK的磷酸化水平在稀疏培養(yǎng)條件下始終被抑制，而在致密培養(yǎng)條件下始終被上調。 KO MDA-MB-231細胞中EGFR的磷酸化水平增加。相比之下，MDA-MB-231 KO細胞中AKT的磷酸化水平降低。在MDA-MB-231敲除細胞中，集落和腫瘤形成的能力均被顯著抑制，這表明β1在腫瘤發(fā)生的細胞存活信號轉導中起重要作用。在Res細胞中拯救了KO細胞中的這些異常表型。綜上所述，這些結果清楚地表明了β1在癌細胞中的獨特作用：抑制細胞生長和促進細胞存活，這可能有所啟發(fā)。

3.敲低BCL2L12導致MDA-MB-231乳腺癌細胞中的順鉑耐藥

?發(fā)現(xiàn)基因BCL2L12在正常乳腺組織中高表達，并且與乳腺癌患者的良好預后相關。研究人員報道，在MDA-MB-231乳腺癌細胞中，順鉑處理后，BCL2L12的mRNA水平及其轉錄變異體BCL2L12A可能被上調。 BCL2L12和BCL2L12A的組合大大抑制了順鉑誘導的細胞凋亡。相反，每種蛋白質的異位表達促進順鉑誘導的細胞凋亡。這些結果表明，BCL2L12和BCL2L12A的表達降低或缺失可能有助于乳腺癌患者的順鉑耐藥性。此外，我們發(fā)現(xiàn)順鉑誘導的β-catenin的下調在BCL2L12-和BCL2L12A敲除的MDA-MB-231細胞中被部分抑制，這表明這兩種蛋白的敲低可能穩(wěn)定順鉑誘導的細胞凋亡中的β-catenin。簡而言之，我們提出BCL2L12和BCL2L12A可能在順鉑誘導的MDA-MB-231乳腺癌細胞凋亡中起重要作用。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生產(chǎn)生產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

源井生物根據(jù)客戶需求，結合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。