KYSE-150細(xì)胞是分化差的食道腺癌細(xì)胞，是從一名接受放射療法的49歲日本女性患者的頸部食道中分離出來(lái)的。當(dāng)研究人員發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系時(shí)，患者的癌組織已侵入鄰近的組織。 KYSE-150細(xì)胞系是具有粘附單層的上皮細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞攜帶的致癌基因c-erb-B（8倍）和細(xì)胞周期蛋白D1（4倍），并且細(xì)胞可以在裸鼠中形成腫瘤，因此KYSE-150細(xì)胞系經(jīng)常用于涉及基因編輯的癌癥研究中，例如CRISPR基因敲除/敲入和點(diǎn)突變。

?應(yīng)用范圍：

1. 在KYSE-150細(xì)胞中敲除EZH2改變了PSMA3-AS1誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞增殖和遷移

在食管癌患者中，PSMA3-AS1表達(dá)上調(diào)并且與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步探索PSMA3-AS1在食管癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，研究人員通過(guò)慢病毒感染在KYSE150和KYSE450細(xì)胞株（PSMA3-AS1表達(dá)較低）中建立了穩(wěn)定的CRISPR PSMA3-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，并驗(yàn)證了其上調(diào)RT-qPCR檢測(cè)PSMA3-AS1。

EZH2的CRISPR / Cas9基因編輯已在KYSE150和KYSE450細(xì)胞中成功進(jìn)行，并通過(guò)EZH2蛋白表達(dá)的顯著降低得到證實(shí)。 CCK-8和集落形成分析表明，敲除CRISPR EZH2后，PSMA3-AS1的過(guò)表達(dá)并不影響食道癌細(xì)胞的增殖（圖6B和6C）。根據(jù)傷口愈合和transwell遷移分析，與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，ESCC EZH2敲除KYSE-150細(xì)胞的傷口愈合和細(xì)胞遷移沒(méi)有增加。

臨床病理特征表明，PSMA3-AS1表達(dá)增加與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，較大的腫瘤大小和ESCC患者的預(yù)后不良呈正相關(guān)。

2. CRISPR過(guò)表達(dá)的KYSE-150細(xì)胞增加ESCC中的化學(xué)抗性

基于全基因組簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列/基于CRISPR的慢病毒文庫(kù)（CRISPR / Cas）是用于基因組規(guī)模功能獲得或功能喪失篩選的強(qiáng)大工具。該系統(tǒng)已被證明在體外鑒定耐藥基因方面非常有效。 Shalem，Kurata和Joung使用CRISPR基因敲除文庫(kù)篩選出了黑色素瘤和AML耐藥性的基本基因。一些研究人員試圖將CRISPR文庫(kù)篩選策略與RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合在KYSE-150細(xì)胞中，以探索ESCC的關(guān)鍵基因和抗化學(xué)性的潛在機(jī)制。

為了增加鑒定參與PTX抗性的必要基因的機(jī)會(huì)，進(jìn)行了綜合分析，以將基因組規(guī)模CRISPR篩選中的EN基因與KYSE-150細(xì)胞系中的差異表達(dá)基因（DE基因）結(jié)合起來(lái)。

研究人員評(píng)估了CDKN1A，ELAVL2和TSPAN4增強(qiáng)ESCC細(xì)胞KYSE-150的化學(xué)耐藥性的潛力。結(jié)果表明，CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4的過(guò)表達(dá)可以顯著增加KYSE-180和KYSE-150細(xì)胞對(duì)PTX的抗性。此外，過(guò)表達(dá)的CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4也可能有助于KYSE-150細(xì)胞的DDP抗性。

3. CRISPR / Cas9介導(dǎo)的KYSE-510細(xì)胞中DEPTOR的敲除顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲

研究人員發(fā)現(xiàn)，DEPTOR的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)ESCC細(xì)胞系的致瘤活性。此外，異位DEPTOR表達(dá)引起KYSE150細(xì)胞的細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的顯著抑制，而KYSE150細(xì)胞的DEPTOR表達(dá)水平最低。同時(shí)，CRISPR / Cas9介導(dǎo)的KYSE-510細(xì)胞中DEPTOR的敲除顯著促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。此外，體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步顯示，與未經(jīng)處理的KYSE150細(xì)胞相比，異位DEPTOR表達(dá)的異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制，而在DEPTOR基因敲除的KYSE-510細(xì)胞中腫瘤生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)。

在這項(xiàng)研究中，科學(xué)家們產(chǎn)生了穩(wěn)定的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系要么過(guò)度表達(dá)DEPTOR，要么通過(guò)遺傳消除內(nèi)源性DEPTOR表達(dá)。由于KYSE-150在三種細(xì)胞系中表達(dá)最低的內(nèi)源性DEPTOR，因此它們?cè)贙YSE-150細(xì)胞（pcDNA3.1-DEPTOR）中穩(wěn)定地過(guò)表達(dá)DEPTOR。出于相同的考慮，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)處理表達(dá)最高水平DEPTOR的KYSE-510細(xì)胞，以敲除DEPTOR（CRISPR-DEPTOR）。細(xì)胞系生成后，與KYSE-150親代細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，pcDNA3.1-DEPTOR表現(xiàn)出降低的細(xì)胞增殖速率，而CRISPR-DEPTOR細(xì)胞的增殖明顯快于對(duì)照KYSE-510細(xì)胞。此外，pcDNA3.1-DEPTOR細(xì)胞也顯示出減少的遷移。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生產(chǎn)生產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

源井生物根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

References:

1. Yan-Mei Ji, Xue-Feng Zhou, Jun Zhang, Xiang Zheng, Sheng-Bao Li, Zhi-Qiang Wei, Tao Liu, Dong-Liang Cheng, Ping Liu, Kuncheng Song, Tao Tan, Hua Zhu, Jia-Long Guo. DEPTOR suppresses the progression of esophageal squamous cell carcinoma and predicts poor prognosis. 2016 Mar 22; 7(12): 14188–14198. Published online 2016 Feb 16.

2. Qiu BQ, Lin XH, Ye XD, et al. Long non-coding RNA PSMA3-AS1 promotes malignant phenotypes of esophageal cancer by modulating the miR-101/EZH2 axis as a ceRNA. Aging (Albany NY). 2020;12(2):1843‐1856.

3. Zhao, Wen-Si et al. “Genome-scale CRISPR activation screening identifies a role of ELAVL2-CDKN1A axis in paclitaxel resistance in esophageal squamous cell carcinoma.” American journal of cancer research vol. 9,6 1183-1200. 1 Jun. 2019

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