1、生物藥物：是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類(lèi)用于預(yù)防、治療和診斷的制品。

2、抗生素：由微生物產(chǎn)生，在低濃度下能殺滅和抑制病原體，但對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用的物質(zhì)，或使用化學(xué)方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。廣義的抗生素還包括一些抗腫瘤藥、殺蟲(chóng)劑和除草劑。

3、補(bǔ)料分批發(fā)酵： 是指將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，間歇式地、或者連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。

4、限制性?xún)?nèi)切酶：生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來(lái)的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DNA卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性?xún)?nèi)切酶。

5、載體：將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。

6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程，失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)而獲得無(wú)限增殖能力的細(xì)胞系。

7、微載體培養(yǎng)：將細(xì)胞吸附于微載體表面，再在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)成單層的方法稱(chēng)為微載體培養(yǎng)法。

8、毛狀根： 受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染后形成的根組織，易于培養(yǎng)，改變了植物的次生代謝。毛狀根生長(zhǎng)快速和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

9、氣升式反應(yīng)器：沒(méi)有攪拌，氣體通過(guò)噴管進(jìn)入剪切力更小，主要用于懸浮細(xì)胞的分批式培養(yǎng)，近年開(kāi)發(fā)用于貼壁細(xì)胞的微載體培養(yǎng)，并進(jìn)行半連續(xù)、連續(xù)和灌流式培養(yǎng)。

10. 酶固定化： 指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶（細(xì)胞）限制或固定于特定空間位置，使之不但能連續(xù)發(fā)揮催化作用，而且反應(yīng)后酶又可以反復(fù)利用的技術(shù)。

11. 抗體酶：又稱(chēng)催化抗體，是指通過(guò)一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)特性，還類(lèi)似于酶，能催化某種反應(yīng)。

12. 微生物轉(zhuǎn)化：是通過(guò)微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,也就是利用微生物謝過(guò)程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對(duì)底物特定部位(基團(tuán))進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)催化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)相似的更有價(jià)值的新化合物。

13. 多克隆抗體：給動(dòng)物接種天然抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物, 它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱(chēng)為多克隆抗體。

14. 單克隆抗體： 通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一

性的抗體。

15. 基因工程抗體：基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進(jìn)行改造和重組，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，便產(chǎn)生了第三代抗體－基因工程抗體。

16. 基因工程多肽疫苗： 利用基因工程技術(shù)制備抗原成分的亞單位的疫苗稱(chēng)為基因工程多肽疫苗。

17. DNA疫苗：DNA疫苗又稱(chēng)核酸疫苗、基因疫苗，是通過(guò)基因重組技術(shù)把編碼抗原蛋白的基因序列克隆到質(zhì)粒，并在基因的上游加上細(xì)胞可以識(shí)別的啟動(dòng)子，形成一個(gè)表達(dá)載體，將這個(gè)表達(dá)載體DNA直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)直接合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，達(dá)到防病治病目的。

18. 基因治療：廣義上來(lái)講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。

19. 細(xì)胞治療技術(shù)： 將患者自身細(xì)胞在體外進(jìn)行處理后回輸體內(nèi)進(jìn)行治療的方法。

20. 生化藥物：所謂生化藥物是指以天然的動(dòng)物、植物、微生物等生物體組織和器官為原料，通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行提取、精制或者用化工合成方法制成的內(nèi)源性生理生化物質(zhì)，用于預(yù)防、治療、診斷疾病。包括由上述這些已知藥物加以結(jié)構(gòu)改造或人工合成創(chuàng)造出的自然界所沒(méi)有的新藥物。

二、簡(jiǎn)答題

1. 簡(jiǎn)述生物藥物新藥的研發(fā)流程。

答：新藥研究和開(kāi)發(fā)的主要過(guò)程：

(1) 確定研究計(jì)劃；

(2) 準(zhǔn)備候選菌株；

(3) 選擇合適藥理模型初篩（搖瓶）、復(fù)篩（小型發(fā)酵）體外試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)；

(4) 提純有效成分進(jìn)行化學(xué)分析 ；

(5) 精制樣品（中型發(fā)酵）；

(6) 臨床前Ⅱ期(Preclinical Ⅱ) ；

(7) Ⅰ期臨床 (Preclinical I)；

(8) Ⅱ期臨床 (Preclinical Ⅱ)；

(9) Ⅲ期臨床 (Preclinical Ⅲ)；

(10) 注冊(cè)申請(qǐng)上市、試生產(chǎn) ；

(11) 售后監(jiān)測(cè)(Post－marketing surveillance)。

2. 簡(jiǎn)述生物藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

答：生物藥物是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類(lèi)用于預(yù)防、治療和診斷的制品。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）用量少，藥理活性高；

（2）特異性強(qiáng)，治療的生理生化機(jī)制合理，療效可靠；

（2）毒副作用小、價(jià)值高；

（3）缺點(diǎn)：

（1）成分復(fù)雜：大多數(shù)是混合物；

（2）不穩(wěn)定：易變性，易失活，易降解。

（3）提取純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)技術(shù)難度高；

（4）生理副作用常有發(fā)生。

3. 給出下列生物藥物的中文名稱(chēng): IFN；TNF；IL；G-CSF；EPO；GM-CSF；r-SK；r-SAK；GH；EGF；bFGF；rhTPO；t-PA；SRM

答：IFN （人α-干擾素）；TNF （腫瘤壞死因子）；IL （白細(xì)胞介素）；G-CSF （粒細(xì)胞集落刺激因子）；EPO （促紅細(xì)胞生成素）；GM-CSF （粒細(xì)胞／巨噬細(xì)胞集落刺激因子）；r-SK （重組鏈激酶）；r-SAK （重組葡激酶）；GH （生長(zhǎng)激素）；EGF （表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）；bFGF （堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）；rhTPO （重組人血小板生成素）；t-PA（ 組織纖溶酶激活劑）；SRM （生長(zhǎng)激素釋放抑制素）。

4. 簡(jiǎn)述微生物發(fā)酵制藥的基本流程。

答：微生物發(fā)酵制藥基本流程：

菌種選育（自然界選種、誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程）

培養(yǎng)基配制（根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實(shí)踐中需多次試驗(yàn)配方）

滅菌（殺滅雜菌（胞體、孢子及芽孢）

擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

發(fā)酵過(guò)程（檢測(cè)進(jìn)程，滿(mǎn)足營(yíng)養(yǎng)需要；嚴(yán)格控制溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等）

分離純化（菌體：過(guò)濾、沉淀；代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換）

5、簡(jiǎn)述基因工程操作流程

答：基因工程的操作流程：

（1）分：分離目的基因；

（2）切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割；

（3）接：目的基因與載體連接；

（4）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；

（5）篩：篩選出含有重組體的受體細(xì)胞；

（6）表：目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，受體細(xì)胞成長(zhǎng)為基因改造生物。

6. 簡(jiǎn)述化學(xué)修飾藥用酶的新特征。

答：藥用酶修飾后所具有的新特征：

（1）對(duì)熱的穩(wěn)定性有所提高。

（2）具有對(duì)抗各類(lèi)失活因子的能力。

（3）抗原性消除。

（4）體內(nèi)的半衰期有所延長(zhǎng)。

（5）最適PH值發(fā)生改變。

（6）酶反應(yīng)特性發(fā)生變化。

（7）在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。

7. 簡(jiǎn)述固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

答：固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)：

（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；

（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易于純化；

（3）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制；

（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少。

缺點(diǎn)：

（1）固定化過(guò)程中，可能會(huì)引起酶活性喪失；

（2）只適用于催化可溶性小分子底物的酶促反應(yīng)，對(duì)大分子底物不適合；

（3）通常不適用于多酶反應(yīng)，尤其是需要輔助因子參與的反應(yīng)。

8. 簡(jiǎn)述單克隆抗體制備的過(guò)程。

答：?jiǎn)慰寺】贵w的制備：

用抗原免疫小鼠 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

免疫脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞

在PEG作用下合成雜交瘤細(xì)胞

選擇培養(yǎng)基（融合的細(xì)胞死亡，雜交瘤細(xì)胞存活）

陽(yáng)性克隆的篩選機(jī)克隆化

克隆擴(kuò)增及大量制備McAb

9. 簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn)。

答：優(yōu)點(diǎn)：

（1）價(jià)格便宜，易形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模；

（2）安全，使用方便；

（3）植物具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

缺點(diǎn)：

（1）表達(dá)量偏低；

（2）免疫效果較差；

（3）糖基化不可靠性、生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問(wèn)題；

（4）目前轉(zhuǎn)基因植物普遍存在基因沉默或不穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象。

10. 簡(jiǎn)述動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)及制作過(guò)程。

答：哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：

（1）通過(guò)乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時(shí)也容易提純。

（2）乳腺是一個(gè)外分泌器官，乳汁不會(huì)參與體內(nèi)循環(huán)，也不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身的生理代謝過(guò)程。

（3）乳汁所表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)修飾加工之后，具有穩(wěn)定的生物活性。

（4）對(duì)于牛、羊這些大量分泌乳汁的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，動(dòng)物本身就相當(dāng)于一座大型的藥物工廠。

動(dòng)物乳腺反應(yīng)器制作：

藥用蛋白基因 表達(dá)細(xì)胞株 細(xì)胞核

供體動(dòng)物 受精卵 無(wú)核受精卵 組裝的核細(xì)胞 胚胎

藥用蛋白 乳汁雌性 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 動(dòng)物幼崽 假孕動(dòng)物

受體動(dòng)物

三、設(shè)計(jì)題

請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)基因工程藥物的生產(chǎn)工藝流程（應(yīng)包括工程菌構(gòu)建、擴(kuò)大培養(yǎng)方法、產(chǎn)物分離純化、質(zhì)量檢測(cè)等環(huán)節(jié)）。

答：干擾素a-2b 的制備

干擾素（INF）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等等作用,是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分,干擾素（INF）最早被用于誘導(dǎo)人體產(chǎn)生白細(xì)胞。

（1）基因工程菌的組建

誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸

↓

通過(guò)寡dT-纖維素柱提取mRNA pBR322質(zhì)粒

↓ ↓

5%-23%蔗糖密度梯度離心提取12S-mRNA PstI內(nèi)切酶切割

↓ ↓

由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA 切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi)

↓ 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素

雙鏈cDNA用末端PstI酶切割 ↓

再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG 在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段加上dA或者dC

++++++++++++++++

退火獲得雜交質(zhì)粒
↓
轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒
↓

篩選能夠抗四環(huán)素、但是對(duì)氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株

↓

采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA的克隆
↓
將干擾素cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體
↓
在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)

↓

（進(jìn)入下游工藝）

（2）基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)

人干擾素a-2b的基因工程菌為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。
質(zhì)粒使用PL啟動(dòng)子，含有四環(huán)素抗性基因。
種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl

↓
基因工程菌接種到4個(gè)1000ml三角燒瓶之中，每個(gè)燒瓶?jī)?nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)10小時(shí)，作為發(fā)酵罐的種子

↓
用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L
↓
攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%
30℃發(fā)酵8小時(shí)，42℃誘導(dǎo)2-3小時(shí)

↓
鑒控手段：每隔不同時(shí)間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱(chēng)量菌體濕重。

（3）干擾素的制備

發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min，除去上清液，得濕菌，從其中取100g。懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）500ml之中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。
↓
4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室溫條件下，進(jìn)行攪拌抽提2小時(shí)

↓
提取液15000r/min離心30min，下層不溶棄去。取上清液，用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）稀釋至尿素濃度0.5mol/L
↓
加入0.1mmol/L二巰基蘇糖醇，4℃攪拌15小時(shí)。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相對(duì)分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮
↓
濃縮液采用Sephadex G50層析柱分離，層析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離
↓
收集人干擾素a-2b部分，用SDS-PAGE檢查。再經(jīng)DE-52柱進(jìn)行純化
層析柱2cm*50cm、上柱之后，分別采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）洗滌。
↓
收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

（4）質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求

（1）半成品檢定--13項(xiàng)指標(biāo)

1、干擾素效價(jià)測(cè)定；2、蛋白質(zhì)含量測(cè)定；3、比活性測(cè)定；

4、純度測(cè)定；5、相對(duì)分子量測(cè)定；6、殘余外源性DNA含量測(cè)定；7、殘余抗生素活性測(cè)定；8、紫外光譜掃描；9、肽圖測(cè)定；10、等電點(diǎn)測(cè)定；11、無(wú)菌試驗(yàn)；12、熱原質(zhì)試驗(yàn)。

（2）成品檢定--7項(xiàng)指標(biāo)

1、物理性狀；2、鑒別試驗(yàn)；3、水分測(cè)定；4、無(wú)菌試驗(yàn)；5、熱原質(zhì)試驗(yàn)；6、干擾素效價(jià)測(cè)定；7、安全試驗(yàn)。

四、論述題

　查閱資料，結(jié)合你的專(zhuān)業(yè)和興趣，請(qǐng)談?wù)勀撤N生物藥物生產(chǎn)工藝國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀，你認(rèn)為存在哪些技術(shù)問(wèn)題，請(qǐng)?zhí)峁┫鄳?yīng)的解決方案。

答：青霉素的生產(chǎn)工藝國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀：

青霉素屬于β-內(nèi)酯類(lèi)抗生素,能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，可從青霉菌的培養(yǎng)液中提制，對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌引起的疾病都具有明顯的治療效果。我國(guó)生產(chǎn)青霉素一部分用作醫(yī)療，有少部分可以先分裂后用來(lái)合成新青霉素或半合成青霉素。

青霉素的生產(chǎn)，包括發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程的控制以及青霉素的提煉。

提煉過(guò)程一般是預(yù)處理、過(guò)濾、萃取、脫色、結(jié)晶。最終得到青霉素產(chǎn)品。

青霉素鈉的提取工藝有溶媒萃取工藝和離子交換工藝。溶媒萃取是利用青霉素在不同的pH條件下，會(huì)以不同的狀態(tài)存在，從而在水和有機(jī)溶劑中具有不同溶解度，通過(guò)多次萃取分離即可達(dá)到分離提純的目的。離子交換工藝采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作為交換劑，將青霉素鉀鹽交換為青霉素鈉鹽。

目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)廠家采用混合槽或靜態(tài)混合器進(jìn)行混合萃取。但是這種裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，拆洗困難，使用不方便。80年代初，已有部分西方國(guó)家開(kāi)始將德國(guó)傾析機(jī)應(yīng)用于青霉素生產(chǎn)并取得成功。近幾年，國(guó)內(nèi)已有廠家開(kāi)始引進(jìn)新型的集過(guò)濾、洗滌、干燥為一體的“三合一”全密閉生產(chǎn)設(shè)備。國(guó)外制藥技術(shù)發(fā)展迅速，由于涉及技術(shù)保密，難以參考到有關(guān)方面的資料。

我認(rèn)為存在的技術(shù)問(wèn)題及解決方案有：

（1）發(fā)酵過(guò)程成本高、能耗大。采用計(jì)算機(jī)青霉素發(fā)酵過(guò)程建模的方法對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化；

（2）發(fā)酵單位需進(jìn)一步提高?？梢詮木N選育及發(fā)酵過(guò)程上進(jìn)一步提高發(fā)酵單位；

（3）菌絲生長(zhǎng)后期，酶易失活，糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為抗生素的效率較低。采用固定化細(xì)胞或固定化全酶的方法改進(jìn)發(fā)酵；

（4）發(fā)酵罐接種工藝存在的問(wèn)題無(wú)法充分發(fā)揮某些菌種的優(yōu)良特性。使用混合接入種源法改良接種工藝；

（5）目前所使用的過(guò)濾設(shè)備過(guò)濾面積小，產(chǎn)能小，在某些條件下收率低。增加鼓式過(guò)濾機(jī)和熱交換器提高收率及濾液質(zhì)量實(shí)現(xiàn)膜萃取分離的方法。