生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)

一、名詞解釋：

1、生物藥物：是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制品。

2、抗生素：由微生物產(chǎn)生，在低濃度下能殺滅和抑制病原體，但對宿主不會產(chǎn)生嚴重的副作用的物質(zhì)，或使用化學(xué)方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。廣義的抗生素還包括一些抗腫瘤藥、殺蟲劑和除草劑。

3、補料分批發(fā)酵： 是指將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間之后，間歇式地、或者連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。

4、限制性內(nèi)切酶：生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶。

5、載體：將外源目的DNA導(dǎo)入受體細胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。

6、轉(zhuǎn)化細胞系：正常細胞經(jīng)過某個轉(zhuǎn)化過程，失去正常細胞的特點而獲得無限增殖能力的細胞系。

7、微載體培養(yǎng)：將細胞吸附于微載體表面，再在培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞在微載體表面生長成單層的方法稱為微載體培養(yǎng)法。

8、毛狀根： 受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染后形成的根組織，易于培養(yǎng)，改變了植物的次生代謝。毛狀根生長快速和次級代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級代謝產(chǎn)物。

9、氣升式反應(yīng)器：沒有攪拌，氣體通過噴管進入剪切力更小，主要用于懸浮細胞的分批式培養(yǎng)，近年開發(fā)用于貼壁細胞的微載體培養(yǎng)，并進行半連續(xù)、連續(xù)和灌流式培養(yǎng)。

10. 酶固定化： 指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶（細胞）限制或固定于特定空間位置，使之不但能連續(xù)發(fā)揮催化作用，而且反應(yīng)后酶又可以反復(fù)利用的技術(shù)。

11. 抗體酶：又稱催化抗體，是指通過一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)特性，還類似于酶，能催化某種反應(yīng)。

12. 微生物轉(zhuǎn)化：是通過微生物細胞將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾,也就是利用微生物謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位(基團)進行的一種或幾種化學(xué)催化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)相似的更有價值的新化合物。

13. 多克隆抗體：給動物接種天然抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物, 它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱為多克隆抗體。

14. 單克隆抗體： 通過B細胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一

性的抗體。

15. 基因工程抗體：基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進行改造和重組，然后導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中進行表達，便產(chǎn)生了第三代抗體－基因工程抗體。

16. 基因工程多肽疫苗： 利用基因工程技術(shù)制備抗原成分的亞單位的疫苗稱為基因工程多肽疫苗。

17. DNA疫苗：DNA疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗，是通過基因重組技術(shù)把編碼抗原蛋白的基因序列克隆到質(zhì)粒，并在基因的上游加上細胞可以識別的啟動子，形成一個表達載體，將這個表達載體DNA直接導(dǎo)入宿主細胞，由細胞的基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)直接合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，達到防病治病目的。

18. 基因治療：廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法。

19. 細胞治療技術(shù)： 將患者自身細胞在體外進行處理后回輸體內(nèi)進行治療的方法。

20. 生化藥物：所謂生化藥物是指以天然的動物、植物、微生物等生物體組織和器官為原料，通過化學(xué)方法進行提取、精制或者用化工合成方法制成的內(nèi)源性生理生化物質(zhì)，用于預(yù)防、治療、診斷疾病。包括由上述這些已知藥物加以結(jié)構(gòu)改造或人工合成創(chuàng)造出的自然界所沒有的新藥物。

二、簡答題

1. 簡述生物藥物新藥的研發(fā)流程。

答：新藥研究和開發(fā)的主要過程：

(1) 確定研究計劃；

(2) 準備候選菌株；

(3) 選擇合適藥理模型初篩（搖瓶）、復(fù)篩（小型發(fā)酵）體外試驗、細胞試驗；

(4) 提純有效成分進行化學(xué)分析 ；

(5) 精制樣品（中型發(fā)酵）；

(6) 臨床前Ⅱ期(Preclinical Ⅱ) ；

(7) Ⅰ期臨床 (Preclinical I)；

(8) Ⅱ期臨床 (Preclinical Ⅱ)；

(9) Ⅲ期臨床 (Preclinical Ⅲ)；

(10) 注冊申請上市、試生產(chǎn) ；

(11) 售后監(jiān)測(Post－marketing surveillance)。

2. 簡述生物藥物的優(yōu)點和缺點。

答：生物藥物是指利用各種生物材料，綜合采用各種生物技術(shù)的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制品。

優(yōu)點：

（1）用量少，藥理活性高；

（2）特異性強，治療的生理生化機制合理，療效可靠；

（2）毒副作用小、價值高；

（3）缺點：

（1）成分復(fù)雜：大多數(shù)是混合物；

（2）不穩(wěn)定：易變性，易失活，易降解。

（3）提取純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)技術(shù)難度高；

（4）生理副作用常有發(fā)生。

3. 給出下列生物藥物的中文名稱: IFN；TNF；IL；G-CSF；EPO；GM-CSF；r-SK；r-SAK；GH；EGF；bFGF；rhTPO；t-PA；SRM

答：IFN （人α-干擾素）；TNF （腫瘤壞死因子）；IL （白細胞介素）；G-CSF （粒細胞集落刺激因子）；EPO （促紅細胞生成素）；GM-CSF （粒細胞／巨噬細胞集落刺激因子）；r-SK （重組鏈激酶）；r-SAK （重組葡激酶）；GH （生長激素）；EGF （表皮細胞生長因子）；bFGF （堿性成纖維細胞生長因子）；rhTPO （重組人血小板生成素）；t-PA（ 組織纖溶酶激活劑）；SRM （生長激素釋放抑制素）。

4. 簡述微生物發(fā)酵制藥的基本流程。

答：微生物發(fā)酵制藥基本流程：

菌種選育（自然界選種、誘變育種、基因工程、細胞工程）

培養(yǎng)基配制（根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實踐中需多次試驗配方）

滅菌（殺滅雜菌（胞體、孢子及芽孢）

擴大培養(yǎng)和接種

發(fā)酵過程（檢測進程，滿足營養(yǎng)需要；嚴格控制溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等）

分離純化（菌體：過濾、沉淀；代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換）

5、簡述基因工程操作流程

答：基因工程的操作流程：

（1）分：分離目的基因；

（2）切：對目的基因和載體適當切割；

（3）接：目的基因與載體連接；

（4）轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞；

（5）篩：篩選出含有重組體的受體細胞；

（6）表：目的基因在受體細胞中表達，受體細胞成長為基因改造生物。

6. 簡述化學(xué)修飾藥用酶的新特征。

答：藥用酶修飾后所具有的新特征：

（1）對熱的穩(wěn)定性有所提高。

（2）具有對抗各類失活因子的能力。

（3）抗原性消除。

（4）體內(nèi)的半衰期有所延長。

（5）最適PH值發(fā)生改變。

（6）酶反應(yīng)特性發(fā)生變化。

（7）在人體組織中的分布能力發(fā)生變化，有利于被靶器官選擇性的吸收。

7. 簡述固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點和缺點。

答：固定化酶生產(chǎn)藥物的優(yōu)點：

（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；

（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化；

（3）反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；

（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少。

缺點：

（1）固定化過程中，可能會引起酶活性喪失；

（2）只適用于催化可溶性小分子底物的酶促反應(yīng)，對大分子底物不適合；

（3）通常不適用于多酶反應(yīng)，尤其是需要輔助因子參與的反應(yīng)。

8. 簡述單克隆抗體制備的過程。

答：單克隆抗體的制備：

用抗原免疫小鼠 骨髓瘤細胞的培養(yǎng)

免疫脾細胞 骨髓瘤細胞

在PEG作用下合成雜交瘤細胞

選擇培養(yǎng)基（融合的細胞死亡，雜交瘤細胞存活）

陽性克隆的篩選機克隆化

克隆擴增及大量制備McAb

9. 簡述轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點。

答：優(yōu)點：

（1）價格便宜，易形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模；

（2）安全，使用方便；

（3）植物具有完整的真核細胞表達系統(tǒng)。

缺點：

（1）表達量偏低；

（2）免疫效果較差；

（3）糖基化不可靠性、生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問題；

（4）目前轉(zhuǎn)基因植物普遍存在基因沉默或不穩(wěn)定表達的現(xiàn)象。

10. 簡述動物乳腺生物反應(yīng)器優(yōu)點及制作過程。

答：哺乳動物乳腺反應(yīng)器優(yōu)點：

（1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時也容易提純。

（2）乳腺是一個外分泌器官，乳汁不會參與體內(nèi)循環(huán)，也不會影響轉(zhuǎn)基因動物自身的生理代謝過程。

（3）乳汁所表達的蛋白質(zhì)經(jīng)過修飾加工之后，具有穩(wěn)定的生物活性。

（4）對于牛、羊這些大量分泌乳汁的動物來說，動物本身就相當于一座大型的藥物工廠。

動物乳腺反應(yīng)器制作：

藥用蛋白基因 表達細胞株 細胞核

供體動物 受精卵 無核受精卵 組裝的核細胞 胚胎

藥用蛋白 乳汁雌性 轉(zhuǎn)基因動物 動物幼崽 假孕動物

受體動物

三、設(shè)計題

請設(shè)計一個基因工程藥物的生產(chǎn)工藝流程（應(yīng)包括工程菌構(gòu)建、擴大培養(yǎng)方法、產(chǎn)物分離純化、質(zhì)量檢測等環(huán)節(jié)）。

答：干擾素a-2b 的制備

干擾素（INF）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等等作用,是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分,干擾素（INF）最早被用于誘導(dǎo)人體產(chǎn)生白細胞。

（1）基因工程菌的組建

誘生的白細胞或者成纖維細胞提取核酸

↓

通過寡dT-纖維素柱提取mRNA pBR322質(zhì)粒

↓ ↓

5%-23%蔗糖密度梯度離心提取12S-mRNA PstI內(nèi)切酶切割

↓ ↓

由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA 切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi)

↓ 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素

雙鏈cDNA用末端PstI酶切割 ↓

再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG 在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段加上dA或者dC

++++++++++++++++

退火獲得雜交質(zhì)粒
↓
轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12擴增雜交質(zhì)粒
↓

篩選能夠抗四環(huán)素、但是對氨芐青霉素敏感的細菌克隆株

↓

采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA的克隆
↓
將干擾素cDNA克隆進表達載體
↓
在大腸桿菌中進行高效表達

↓

（進入下游工藝）

（2）基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)

人干擾素a-2b的基因工程菌為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。
質(zhì)粒使用PL啟動子，含有四環(huán)素抗性基因。
種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl

↓
基因工程菌接種到4個1000ml三角燒瓶之中，每個燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)10小時，作為發(fā)酵罐的種子

↓
用15L發(fā)酵罐進行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L
↓
攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%
30℃發(fā)酵8小時，42℃誘導(dǎo)2-3小時

↓
鑒控手段：每隔不同時間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。

（3）干擾素的制備

發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min，除去上清液，得濕菌，從其中取100g。懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）500ml之中，冰浴條件下進行超聲破碎。
↓
4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室溫條件下，進行攪拌抽提2小時

↓
提取液15000r/min離心30min，下層不溶棄去。取上清液，用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）稀釋至尿素濃度0.5mol/L
↓
加入0.1mmol/L二巰基蘇糖醇，4℃攪拌15小時。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮
↓
濃縮液采用Sephadex G50層析柱分離，層析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離
↓
收集人干擾素a-2b部分，用SDS-PAGE檢查。再經(jīng)DE-52柱進行純化
層析柱2cm*50cm、上柱之后，分別采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）洗滌。
↓
收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

（4）質(zhì)量控制標準和具體要求

（1）半成品檢定--13項指標

1、干擾素效價測定；2、蛋白質(zhì)含量測定；3、比活性測定；

4、純度測定；5、相對分子量測定；6、殘余外源性DNA含量測定；7、殘余抗生素活性測定；8、紫外光譜掃描；9、肽圖測定；10、等電點測定；11、無菌試驗；12、熱原質(zhì)試驗。

（2）成品檢定--7項指標

1、物理性狀；2、鑒別試驗；3、水分測定；4、無菌試驗；5、熱原質(zhì)試驗；6、干擾素效價測定；7、安全試驗。

四、論述題

　查閱資料，結(jié)合你的專業(yè)和興趣，請談?wù)勀撤N生物藥物生產(chǎn)工藝國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀，你認為存在哪些技術(shù)問題，請?zhí)峁┫鄳?yīng)的解決方案。

答：青霉素的生產(chǎn)工藝國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀：

青霉素屬于β-內(nèi)酯類抗生素,能破壞細菌的細胞壁，可從青霉菌的培養(yǎng)液中提制，對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌引起的疾病都具有明顯的治療效果。我國生產(chǎn)青霉素一部分用作醫(yī)療，有少部分可以先分裂后用來合成新青霉素或半合成青霉素。

青霉素的生產(chǎn)，包括發(fā)酵過程，發(fā)酵過程的控制以及青霉素的提煉。

提煉過程一般是預(yù)處理、過濾、萃取、脫色、結(jié)晶。最終得到青霉素產(chǎn)品。

青霉素鈉的提取工藝有溶媒萃取工藝和離子交換工藝。溶媒萃取是利用青霉素在不同的pH條件下，會以不同的狀態(tài)存在，從而在水和有機溶劑中具有不同溶解度，通過多次萃取分離即可達到分離提純的目的。離子交換工藝采用陽離子交換樹脂作為交換劑，將青霉素鉀鹽交換為青霉素鈉鹽。

目前國內(nèi)大多數(shù)廠家采用混合槽或靜態(tài)混合器進行混合萃取。但是這種裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜，拆洗困難，使用不方便。80年代初，已有部分西方國家開始將德國傾析機應(yīng)用于青霉素生產(chǎn)并取得成功。近幾年，國內(nèi)已有廠家開始引進新型的集過濾、洗滌、干燥為一體的“三合一”全密閉生產(chǎn)設(shè)備。國外制藥技術(shù)發(fā)展迅速，由于涉及技術(shù)保密，難以參考到有關(guān)方面的資料。

我認為存在的技術(shù)問題及解決方案有：

（1）發(fā)酵過程成本高、能耗大。采用計算機青霉素發(fā)酵過程建模的方法對發(fā)酵過程進行優(yōu)化；

（2）發(fā)酵單位需進一步提高?？梢詮木N選育及發(fā)酵過程上進一步提高發(fā)酵單位；

（3）菌絲生長后期，酶易失活，糖類轉(zhuǎn)化為抗生素的效率較低。采用固定化細胞或固定化全酶的方法改進發(fā)酵；

（4）發(fā)酵罐接種工藝存在的問題無法充分發(fā)揮某些菌種的優(yōu)良特性。使用混合接入種源法改良接種工藝；

（5）目前所使用的過濾設(shè)備過濾面積小，產(chǎn)能小，在某些條件下收率低。增加鼓式過濾機和熱交換器提高收率及濾液質(zhì)量實現(xiàn)膜萃取分離的方法。