基因操作基本技術(shù)及原理—電泳

電泳：

電泳是指帶粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同，常用泳動度（或遷移率）來表示，泳動度是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下電泳的速度。電泳技術(shù)以支持物分為紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，淀粉凝膠電泳，瓊脂（糖）凝膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。以凝膠形狀分為水平平板電泳，園盤柱狀電泳及垂直平板電泳。

用支持體的電泳技術(shù)：

1.紙上電泳。2.醋酸纖維薄膜電泳。3.薄層電泳。4.非凝膠性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)。5.凝膠支持體區(qū)帶電泳：①淀粉液②聚丙烯酰胺凝膠③瓊脂（糖）凝膠。

不用支持體的電泳技術(shù)：

1.Tiselius或微量電泳。2.顯微電泳。3.等電點(diǎn)聚焦電泳技術(shù)。4.等速電泳技術(shù)。5.密度梯度電泳。

核酸的凝膠電泳

在凝膠電泳中，首先應(yīng)用的是瓊脂電泳，它具有下列優(yōu)點(diǎn)：

（1）瓊脂含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小，對蛋白質(zhì)的吸附極微。

（2）瓊脂作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

（3）電泳速度快。

（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。

（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收。

01.瓊脂糖凝膠電泳

可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡單、迅速，能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物，分開的DNA可用低濃度的熒光染料（0.5μg/ml溴化乙錠）染色，在紫外燈下直接觀察檢測少至1ng的DNA。

DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù)：

①DNA分子的大小：線狀雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測分子量的DNA片段同時電泳，比較其電泳速率，即可求出待測片段的分子大小。

②瓊脂糖濃度：給定大小的DNA片段，以不同速度通過不同濃度的瓊脂糖凝膠。因此利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛，大小不同的DNA片段。

③DNA構(gòu)型：相同分子量的閉環(huán)（Ⅰ型），開環(huán)（Ⅱ型）和線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠，一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。

④應(yīng)用的電壓：在低電壓時，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是電壓增高時，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的，因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力，凝膠電泳時電壓不應(yīng)超過5V/cm。

02.聚丙烯酰胺凝膠電泳

可用于分析和制備小于1Kb長度的DNA片段。聚丙烯胺凝膠多用垂直平板電泳，準(zhǔn)備凝膠時，先配制30%單體母液（29克丙烯酰胺，1克雙丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它來配制所需濃度的凝膠。每100ml上述液體加30μl四甲基乙胺（TEMED），混勻后即可灌注于予先準(zhǔn)備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板，待凝膠灌至近頂端時，立即插入合適的“梳子”，放室溫聚合60分鐘，若冬天室溫太低，則可放37度溫箱內(nèi)，以促進(jìn)聚合。

聚合完成后，拔出“梳子”，將凝膠板固定于電泳槽中，向電泳槽傾入1×TBE，用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部以除去氣泡，即可加樣電泳。一般所用電壓1-8v/cm，隨時觀察標(biāo)記染料的遷移。電泳結(jié)束，從電槽中取出玻板并小心地撬開，凝膠浸于溴化乙錠液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

分子量參照物：為了判斷目的DNA片段的大小，常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物，同時電泳并染色后，就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量參照物是HindⅢ消化物，各片段的大小以bp表示，分別為：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。