Nat Neurosci系統(tǒng)總結(jié)：突觸前的光遺傳學
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近年來，隨著光遺傳學技術的發(fā)展，其在神經(jīng)科學領域的應用越來越廣泛。得益于其對靶向目標的專一性，操縱時間上的快速性和精確性，相比于化學遺傳學等其他的方法，光遺傳學成為操縱突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放的最佳方法。然而，由于光遺傳學工具多種多樣，在使用前需要了解它們的特性以及它們靶向目標的特性。
Ofer Y教授團隊據(jù)此總結(jié)了光遺傳學工具在突觸前的種類和應用策略，并將其成果“Optogenetics at the presynapse”于2022年7月發(fā)表于Nature Neuroscience 雜志。
光遺傳學工具的生物物理特性
目前使用的光遺傳學工具主要分為三類：視紫紅質(zhì)、藍光受體（BLRs）以及光敏劑。視紫紅質(zhì)包含了一個7個螺旋的膜蛋白（視蛋白），視黃醛發(fā)色團鑲嵌其中并與視蛋白共價結(jié)合，光刺激后視黃醛會出現(xiàn)構象改變，從而改變其狀態(tài)。
視紫紅質(zhì)分為I類（微生物型）視紫紅質(zhì)和II類（動物型）視紫紅質(zhì)，其中I類又分為光敏通道蛋白（ChRs，被動轉(zhuǎn)運的離子通道)，光驅(qū)動的離子泵（主動轉(zhuǎn)運）以及酶視紫紅質(zhì)，II類則是特異性被光激活的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），也可以分為視覺型視紫紅質(zhì)（視感蛋白、視錐蛋白）和非視覺型視紫紅質(zhì)。
BLRs使用黃素作為發(fā)色團，有黃素單核苷酸（FMN），黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及核黃素，BLRs可以控制多個效應蛋白，在光消失之后，也會存在殘留的暗活性，無法做到精準的時間控制，主要應用在植物和細菌中。BLRs可以分為光-氧-電壓域（LOV）、藍光傳感器利用FAD域（BLUF）以及隱花色素（CRYs）。
遺傳編碼的光敏劑都源于擬南芥向光素2的綠色熒光蛋白或者LOV2區(qū)域，照射后，會產(chǎn)生活性氧，單線態(tài)氧會氧化多種氨基酸側(cè)鏈，從而在20-150nm光下使相應的蛋白質(zhì)失活（原位發(fā)色團輔助光失活(CALI)）。
圖1.光遺傳致動器概述
靶向光遺傳學驅(qū)動器于軸突和突觸前
由于大部分的光遺傳學工具都源自于種系發(fā)生很遠的物種，在哺乳動物細胞中缺乏定位信號，因此經(jīng)常會導致光遺傳學工具無效的膜定位，細胞內(nèi)聚集以及高濃度時的細胞毒性。
目前沒有通用信號序列用于靶向光遺傳學工具于軸突和突觸前，但是有兩種機制可以促進軸突定位：一是通過胞體樹突部位優(yōu)先胞吞的單向膜插入，二是通過特異性囊泡進行的軸突導向的轉(zhuǎn)運，例如將光遺傳學工具融合到突觸素中，可以促進它在突觸前細胞質(zhì)或者突觸囊泡腔的表達升高（圖2）。
圖2.光遺傳致動器的軸突運輸和突觸前靶定
光遺傳學工具在突觸前的應用
光敏通道輔助的環(huán)路映射（CRACM）主要促進突觸前釋放，其策略是將陽離子型ChR（CCR）表達于突觸前，之后光照射目標區(qū)域，導致軸突膜去極化，從而產(chǎn)生動作電位（AP），之后AP引起鈣離子內(nèi)流，從而導致突觸前釋放，同時檢測突觸后的電流，從而觀測兩者之間的功能連接。
但CRACM也存在問題，即AP產(chǎn)生之后，向下傳導的同時，也會逆向傳導，導致側(cè)枝突觸前釋放，使得體內(nèi)CRACM實驗結(jié)果變得復雜。在體外腦切片中，可以通過同時抑制突觸前鈉離子和鉀離子通道，使光照后目標區(qū)域有鈉離子內(nèi)流的同時不產(chǎn)生AP，并激發(fā)鈣離子內(nèi)流從而釋放神經(jīng)遞質(zhì)。
在生物中可以通過局部注射利多卡因或者特異性阻斷突觸后受體來達到上述效果。相比于電刺激，光刺激突觸前末端會產(chǎn)生更大的突觸后反應，而且不同的實驗流程、不同的通路以及不同的細胞類型，光遺傳學刺激的效果都可能不同（圖3）。
圖3.通過CCR刺激導致的光誘導的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的概念和缺陷
光遺傳學抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放則有3種策略：
其一，通過外向的質(zhì)子泵（ArchT, Arch3, Jaws)或者內(nèi)向的氯離子泵（NpHR）使軸突膜超極化從而抑制AP的傳播，降低突觸前鈣離子內(nèi)流。遞質(zhì)傳遞的降低在光照瞬間發(fā)生，并在照明終止后的幾秒鐘內(nèi)消失。這種方法適合快速抑制的實驗，因為一旦時間加長（幾分鐘）就會產(chǎn)生其他非預期效應。
其二，通過GPCRs抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放，突觸前的GPCRs本身就是天然的突觸前釋放抑制劑，GPCRs有3個不同的亞基，α，β和γ，β和γ亞基可以與電壓門控的鈣離子通道（VGCCs）相互作用從而降低它的開放概率，此外，這兩個亞基可以直接干擾SNARE介導的囊泡與膜融合，抑制突觸前釋放。非視覺型II類視紫紅質(zhì)與G蛋白偶聯(lián)受體偶聯(lián)，且不會產(chǎn)生光漂白的現(xiàn)象從而可以成為有效的抑制突觸前釋放的工具（optoGPCRs），目前描述地最多的是來自八目鰻的側(cè)視蛋白（LcPPO）以及來自蚊子的OPN3。
其三，由光敏劑介導CALI（InSynC）系統(tǒng)以及AsLOV2衍生的iLID二聚體系可以直接損傷釋放裝置，損傷囊泡釋放相關蛋白從而抑制突觸前釋放。相比上述兩種方式，該方式的起效時間和持續(xù)時間都比較長，而且由于該方法直接損傷相關蛋白，因此恢復時間會根據(jù)不同的部位以及相關蛋白合成時間的長短而不同（圖4）。
圖4.光遺傳學抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的不同原理
相對光遺傳學刺激神經(jīng)遞質(zhì)釋放，它抑制釋放的效果更難被確認，因此在實驗設定中需要驗證它的表達和表現(xiàn)（圖5）。
圖5.光遺傳突觸前抑制的驗證
結(jié) 論
突觸前的光遺傳學工具為神經(jīng)科學家提供了多種實驗方法來進行精細地操作神經(jīng)元，了解它的分類和應用對于之后如何使用以及光遺傳學的發(fā)展至關重要。
參考文獻
Benjamin R, et al. Optogenetics at the presynapse. Nature Neuroscience, 2022. DOI: 10.1038/s41593-022-01113-6.
編譯作者：KK（brainnews創(chuàng)作團隊）
校審：Simon（brainnews編輯部）
