T? cells

T細胞是獲得性免疫的重要組成部分，起源于骨髓中的淋巴樣祖細胞，在胸腺中分化、發(fā)育、成熟，通過淋巴液和血液循環(huán)進入機體免疫器官之中發(fā)揮細胞免疫及免疫調(diào)節(jié)功能。T細胞是機體獲得性免疫中發(fā)揮功能最為重要的一類淋巴細胞。根據(jù)其表面標志物和功能特征，T細胞可以分化為不同的亞群(如圖1所示)。

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1T細胞分類
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根據(jù)T細胞分化階段分類

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（1）初始T細胞（Naive T-Cell）：是指未經(jīng)抗原刺激，還未分化成熟的T細胞。

（2）效應(yīng)T細胞（Effector T-Cell）：是指經(jīng)過抗原刺激，增殖分化，成熟可以執(zhí)行效應(yīng)功能的T細胞。具有細胞因子釋放，細胞殺傷等功能。

（3）記憶T細胞（Memory T-Cell）：是指一些經(jīng)過抗原刺激，增殖分化形成的能夠長期存活，可以介導再次免疫的細胞。

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根據(jù)T細胞功能分類?

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（1）輔助性T細胞（T helper cells, Th）為CD4+ T細胞，包括Th0，Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh等。其中未激活的初始CD4+ T細胞為Th0，在各種抗原和細胞因子的刺激與調(diào)控下，分化成不同類型的Th。

（2）細胞毒性T細胞（Cytotoxic T cell）為CD8+T細胞，被激活后可以釋放細胞因子，穿孔素，顆粒酶用于殺傷病毒感染的細胞或者腫瘤細胞。

（3）調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）為體內(nèi)維持免疫平衡的一類T細胞，既有CD4+T調(diào)節(jié)性T細胞，又有CD8+T細胞，這類T細胞通常與自身免疫疾病及腫瘤進展相關(guān)。

圖1.T細胞分化及類型

2T細胞激活與擴增

T細胞體內(nèi)激活與擴增

TCR與CD3分子形成TCR-CD3復合物，TCR負責識別抗原肽，CD3負責將TCR接到的細胞外刺激信號傳導到胞內(nèi)，經(jīng)過胞內(nèi)信號傳導將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)化為細胞功能活化信號。如圖2所示，研究表明Na?ve細胞激活需要兩個不同的細胞外信號的共同刺激：第一個信號來自于抗原，由APC表面的MHC-抗原肽復合物與TCR(包括CD4和CD8)的相互作用形成復合物，由CD3傳入細胞內(nèi)，該信號保證了免疫應(yīng)答的特異性。第二信號為共刺激分子的結(jié)合，其提供方式為APC表面的共刺激分子與T細胞表面相應(yīng)配體的相互作用和結(jié)合，該信號確保免疫應(yīng)答在需要的條件下才能發(fā)生。目前研究最為清楚的共刺激分子包括APC表面的CD80,CD86,T細胞表面的CD28,T細胞表面的CD28向胞內(nèi)傳遞活化信號，包括促進IL-2產(chǎn)生和初始T細胞分化成為效應(yīng)T細胞和記憶性T細胞。其他第二信號分子配體對包括ICAM-1/LFA-1、LFA-3/CD2、B7-H2/ICOS、CD40/CD40L等。

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當T細胞只有第一信號，缺乏第二信號時，T細胞處于無應(yīng)答狀態(tài)，必須在第一信號和第二信號同時存在時，T細胞才發(fā)生活化。第二信號確保在正確的時間與部位啟動T細胞應(yīng)答。T細胞的活化信號觸發(fā)了某些T細胞膜蛋白和細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)表達，這一結(jié)果引發(fā)了活化后細胞的分裂和分化，T細胞增值與活化并行。專職APC經(jīng)MHCⅡ途徑提呈外源性抗原刺激初始CD4+T細胞活化，分化成為輔助T細胞。APC經(jīng)MHCⅠ類途徑提呈內(nèi)源性抗原刺激CD8+T細胞活化、分化成為細胞毒性T細胞?；罨腡細胞具有分泌細胞因子與殺傷細胞的功能。

圖2.T細胞激活的兩個信號

T細胞體外激活與擴增如圖3所示，體外T細胞的刺激便于T細胞的激活與擴增，為T細胞功能研究以及T細胞治療提供了便利，絲裂原分子和抗體是常用的體外刺激分子。常用的絲裂原分子主要作用于TCR,CD2,CD3,CD28和CD45等分子。單克隆抗體以其特異性可以特異性結(jié)合TCR-CD3復合物繞過TCR-MHC抗原肽復合物經(jīng)典通路提供T細胞激活的第一信號，但是擴增還需要依賴共刺激信號，通常由CD28分子提供【4】。游離的抗體可以結(jié)合在T細胞表面，但是無法讓受體產(chǎn)生足夠的交聯(lián)成簇，也就無法有效的激活T細胞。因此借助輔助細胞，或者將抗體包被使用，更為簡潔方便的是將CD3和CD28抗體偶聯(lián)磁珠，該類產(chǎn)品是將CD3和CD28抗體偶聯(lián)在直徑約為4.5μm左右的磁珠上，使用是將細胞與磁珠按比例混合后混勻后培養(yǎng)，刺激結(jié)束用磁力架吸附輕松移除磁珠，終止刺激。運用4.5μm抗體偶聯(lián)磁珠大小與細胞大小完美匹配、模擬APC高效激活擴增T細胞。

圖3.T細胞體內(nèi)外激活途徑

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3T細胞過繼療法在腫瘤治療中的應(yīng)用

T細胞免疫療法是一種利用自身免疫細胞更好殺傷腫瘤細胞的治療方法。目前有三種重要的T細胞免疫療法（圖4），即TIL療法，TCR-T細胞以及CAR-T療法。三類T細胞療法都是收集分離自身免疫細胞，在體外進行大量擴增或者基因工程化改造并擴增后回輸給病人，該療法稱為細胞免疫療法。

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采集的病人T細胞，一般需要2-8周左右的增殖時間。在此期間，病人可以采用化療，放療來清除一些其它免疫細胞，減少一些自身免疫細胞有助于提升過繼T的效應(yīng)功能。通過這些處理之后，體外培養(yǎng)、改造、擴增的T細胞回輸病人獲得治療。

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圖4.T細胞療法

TIL療法

即腫瘤浸潤T淋巴細胞，最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)有一群淋巴細胞可以更好地識別腫瘤細胞，但是在數(shù)量上還不足或者因為腫瘤微環(huán)境的抑制信號使得它們無法完全殺傷腫瘤細胞，隨后他們分離了這群淋巴細胞，并實現(xiàn)了體外快速擴增與激活，最后將這群細胞回輸給患者，大量激活的TIL細胞在患者體內(nèi)精確定位尋找并殺傷腫瘤細胞。

工程化TCR療法并不是所有患者都有那樣幸運可以識別腫瘤細胞的T細胞，一些患者由于種種原因，無法分離得到大量擴增激活的T細胞，對于這些患者，醫(yī)生一般采用工程化TCR-T細胞療法，該方法也需要分離病人的T細胞，取代體外擴增激活的辦法是采用基因工程化對T細胞進行編輯，給T細胞裝載一個能特異性識別腫瘤抗原的TCR，這一策略允許醫(yī)生根據(jù)病人腫瘤的具體情況設(shè)計不同的TCR，更加個性化。最后將工程化T細胞激活，擴增回輸給患者。CAR-T療法

無論是TIL還是TCR-T細胞療法，識別腫瘤抗原都必須依賴于形成TCR-MHC抗原肽復合物，為了克服這一局限性，CAR-T應(yīng)用而生。科學家給T細胞裝載上可以特異性識別腫瘤細胞表面抗原的一段序列即嵌合抗原受體（CAR），通常CAR是一段抗體序列，通過對CAR的精心設(shè)計，使得T細胞可以特異性識別腫瘤表面抗原，從而繞過了T細胞通過形成TCR-MHC抗原肽復合物被激活的通路，CAR與腫瘤細胞表面抗原的結(jié)合就可以激活T細胞，拓寬了T細胞治療的應(yīng)用場景。

4CAR的結(jié)構(gòu)
?抗原結(jié)構(gòu)域

一般為與腫瘤細胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體形式，有抗體的單鏈可變區(qū)片段scFV，有納米抗體VHH，目前還有結(jié)合雙抗原表位的scFV串聯(lián)形式，兩個VHH的串聯(lián)形式等，主要負責特異性識別腫瘤表面抗原。

間隔結(jié)構(gòu)域

從功能上講，間隔結(jié)構(gòu)域主要起到聯(lián)系抗原識別結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的作用，通常選用CD8α或者CD28的胞外區(qū)部分，間隔結(jié)構(gòu)域的長短取決于抗原識別結(jié)構(gòu)域所識別的抗原表位，及抗原表位的可及性。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜結(jié)構(gòu)域主要傳導CAR識別抗原的信號到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以及T細胞的其他一些膜蛋白。通?？缒そY(jié)構(gòu)域來自CD4, CD8α，CD28 和 CD3ζ，他們的選擇最終極大地影響著CAR-T的作用效果。

胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域

胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域通常來自于CD28家族（CD28,ICOS）或者腫瘤壞死因子受體家族(4-1BB, OX40, CD27). (4-1BB, OX40, CD27)。共刺激結(jié)構(gòu)域可實現(xiàn)協(xié)同刺激分子和細胞內(nèi)信號的雙重活化，使T細胞持續(xù)增殖并釋放細胞因子，提高CAR-T的抗腫瘤能力。

5細胞治療熱門要點
CAR-T療法CAR-T療法至今經(jīng)歷了五代（圖5）：第一代CAR-T僅依賴于CD3ζ介導T細胞激活，由于胞內(nèi)缺乏共刺激結(jié)構(gòu)域，自然缺少共刺激信號，因此T細胞激活有限，而且無法長時間擴增，臨床療效有限；第二代CAR-T在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)增加一個共刺激分子（CD28、4-1BB、ICOS 或 OX40等）延長了T細胞的增殖時間，提高了CAR-T活性。第三代 ? CAR-T在二代基礎(chǔ)上增加了一個共刺激結(jié)構(gòu)域，在現(xiàn)有的共刺激結(jié)構(gòu)域中，大量的CAR-T采用了CD28和4-1BB作為共刺激分子，研究表明4-1BB作為共刺激信號的CAR-T細胞在體內(nèi)擴增更溫和持久，發(fā)生細胞因子風暴風險較低，殺傷腫瘤效果更好，復發(fā)風險低；第四代CAR-T引入了組成型或者誘導表達的促炎癥細胞因子（IL-12、IL-15、IL-18 ? 等）和共刺激配體，可以有效解除腫瘤免疫微環(huán)境的抑制，例如，當CAR-T細胞中過度表達的細胞因子是IL-12，可以增強T細胞分泌IFNγ、顆粒酶B和穿孔素的有效分子，從而招募NK細胞等免疫細胞殺傷CAR-T未能識別的腫瘤細胞,起到聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的橋梁作用；第五代CAR-T則是在第二代的基礎(chǔ)上，添加了激活其它信號通路的共刺激結(jié)構(gòu)域，比如IL2-2Rβ胞內(nèi)結(jié)合STAT3/5 的結(jié)構(gòu)域等。

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圖5.CAR-T療法發(fā)展歷程

細胞免疫療法研究現(xiàn)狀

據(jù)藥融云數(shù)據(jù)庫，目前全球已有7款CAR-T療法獲批上市，分別是：

諾華 的 Kymriah (tisagenlecleucel)；

Gilead/Kite 的 Yescarta (axicabtageneciloleucel)；

吉利德 的 Tecartus (brexucabtageneautoleucel)；

BMS 的 Breyanzi (lisocabtagene maraleucel)；

BMS 和 藍鳥生物 的 abecma (idecabtagenevicleucel)；

復星凱特 的 阿基侖賽注射液；

藥明巨諾 的 瑞基侖賽注射液。

細胞治療趨勢與熱門治療方式

如圖6所示，截止到2022年4月15日，在全球腫瘤免疫細胞治療管線中有2756種處于活躍開發(fā)狀態(tài)的細胞療法，而2021年的活躍狀態(tài)有2031種，同比增長36%，這意味著腫瘤細胞治療的研發(fā)增長了36%。相較2020年至2021年與2019年至2020年的增幅43%和61%略有放緩，其中NK細胞療法放緩了增速（去年同比增長55%，前年增長65%）；CAR-T細胞療法去年同比增長24%，低于2020-2021年38%的增長，盡管如此，CAR-T細胞療法依然繼續(xù)引領(lǐng)著細胞治療管道。除了具體的細胞療法，異體細胞療法相比自體細胞療法也有增長，去年異體細胞療法增速為33%，自體細胞療法增速為23%。

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圖6.全球免疫腫瘤學管線概況

細胞治療熱門靶點

2021年，血液腫瘤治療領(lǐng)域，TOP5熱門的靶點仍然是CD19,BCMA,CD22,CD20,CD123。盡管一些靶點還不在TOP5，但這些新靶點增長趨勢迅猛，比如GPRC5D增長200%，CLEC12A增長114%，CD7增長78%。實體瘤治療領(lǐng)域熱門靶點，腫瘤相關(guān)表面抗原TAA,HER2,MSLN,GPC2/3,EGFR占據(jù)TOP5，盡管也有一些靶點還不在熱門靶點榜單,但是發(fā)展勢頭超乎尋常，CLDN18增長400%，CD276增長160%，就連帶著不可成藥魔咒標簽的Kras也增長125%（圖7）。

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圖7.血液腫瘤和實體瘤細胞療法的主要靶點

細胞治療領(lǐng)域熱門靶點如下：

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6細胞治療臨床前景
根據(jù)ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)顯示，截止2022年4月，有近1800項細胞治療臨床試驗處于活躍狀態(tài)（圖8）。與去年相比，同比增長33%，2020-2021年的增速為43%，2019-2020年的增速為24%。這種緩慢現(xiàn)象在包括NK/NKT細胞治療的所有細胞治療中。盡管2020下半年這種緩慢增速略有恢復。其它細胞療法持續(xù)增速，與前些年一致，細胞治療依然集中在血液腫瘤治療領(lǐng)域。但是評估實體瘤細胞治療療效的試驗有了顯著增速，2021-2022增速為43%。

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圖8.全球細胞治療臨床試驗增速概況

討論：細胞療法盡管增速與前些年相比有所放緩，但是T細胞療法仍然遙遙領(lǐng)先。細胞治療臨床研發(fā)管線仍然處于增長狀態(tài)。這種增速放緩的主要原因是不依賴于T細胞治療的其他細胞療法已經(jīng)有所固化，限制了這些療法的增長?？赡艿脑蚴仟毩⒌奶囟ò悬c，更好的安全性、與T細胞療法互補的作用機制或它們“快速”生產(chǎn)的可行性等等。根據(jù)ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)顯示，盡管實體瘤治療領(lǐng)域有所增速，但是CAR-T療法在實體瘤領(lǐng)域的應(yīng)用仍然趕不上研發(fā)速度。一些關(guān)鍵的限制因素可能是對患者資格、治療費用、旅行要求和相關(guān)患者的負擔不完全了解。未來，學術(shù)界、政府和工業(yè)界必須繼續(xù)合作，更加重視細胞療法的培訓、實施、報銷和商業(yè)化戰(zhàn)略。臨床發(fā)展的限制因素應(yīng)該和臨床研究并行。這樣我們可以在實現(xiàn)臨床研發(fā)管線增速的同時，更好的將成果及時轉(zhuǎn)化。

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關(guān)于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立十余年專注細胞和基因治療（CGT）上游GMP級原料試劑研發(fā)，致力于為生命科學提供可靠的產(chǎn)品與服務(wù)。產(chǎn)品涉及真核重組蛋白、細胞分選試劑、無血清培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)試劑盒、工具酶。為細胞和基因治療、mRNA開發(fā)、抗體藥物開發(fā)、細胞儲存等生物制藥和IVD領(lǐng)域提供核心原料試劑與服務(wù)。

公司建有符合cGMP標準的萬級潔凈車間，包括哺乳動物細胞表達蛋白質(zhì)工程平臺、細胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)平臺、體外診斷試劑生產(chǎn)平臺，通過ISO13485和ISO9001雙認證，部分產(chǎn)品已獲美國FDA DMF備案。