寫在前面

????????今天推薦的是由澳大利亞圣文森特醫(yī)學(xué)研究所團隊在2020年2月4日發(fā)表于Front Cell Dev Biol（IF：5.196，JCR 2區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Andrew J. Deans教授，研究表明ATR激酶促進FANCD2在DNA修復(fù)中以泛素化的形式積聚，從而維持FA途徑的激活。

研究背景

????????DNA鏈間交聯(lián)（ICLs）是復(fù)制的物理屏障，對細胞活力有毒性。ICLs阻止DNA鏈分離，從而抑制DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制相關(guān)復(fù)合物的正常功能。許多化療藥物通過誘導(dǎo)ICLs殺死癌細胞。修復(fù)ICLs的關(guān)鍵步驟是通過單泛素化對FA途徑中的FANCD2蛋白進行生化修飾。該途徑的遺傳缺陷導(dǎo)致Fanconi貧血（FA），其特征是對DNA交聯(lián)劑敏感、骨髓衰竭、不孕不育和癌癥易感性。

????????FA途徑是去除ICLs進行DNA修復(fù)的一個重要機制，該途徑由FANCD2及其伴侶蛋白FANCI的單泛素化啟動。FANCD2的單泛素化在時間和空間上受FA核心復(fù)合物（E3環(huán)連接酶）、USP1:UAF1（去泛素化酶）和ATR激酶的調(diào)控。FANCI是FANCD2的異源二聚體，在這一調(diào)控中起著重要作用。特別是，F(xiàn)ANCI本身是FA核心復(fù)合物的單泛素化靶點，又是ATR激酶的底物，并含有FANCD2去泛素化所必需的USP1:UAF1的結(jié)合位點。在ICL修復(fù)過程中，F(xiàn)ANCD2作為異源二聚體與FANCI結(jié)合，向含有泛素結(jié)合域的DNA修復(fù)蛋白發(fā)出信號，并通過同源重組或轉(zhuǎn)譯合成促進DNA修復(fù)。

摘要部分

????????作者的研究證明了FANCD2和FANCI單泛素化形式的維持是由ATR激酶調(diào)控的。在生化重組實驗中，作者發(fā)現(xiàn)ATR直接在556、559和565位的絲氨酸（S）上磷酸化FANCI，從而穩(wěn)定FANCI與DNA和FANCD2的結(jié)合。這種與DNA結(jié)合的增強會刺激泛素與FANCI和FANCD2結(jié)合，也抑制了它們的去泛素化。利用FANCI模擬磷酸化和去磷酸化的突變體，作者發(fā)現(xiàn)S559和S565對于保護復(fù)合物免受去泛素化酶USP1:UAF1的影響特別重要。作者的研究結(jié)果表明，ATR激酶可以促進泛素化形式的FANCD2在DNA修復(fù)中積聚，這是ATR激酶維持FA通路激活的一個主要機制。

研究內(nèi)容

1.重組FANCI:FANCD2復(fù)合物的去磷酸化抑制其在體外的單泛化? ? ?

????????作者從桿狀病毒感染的昆蟲細胞中純化獲得一定比例的重組FANCI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在S/TQ簇結(jié)構(gòu)域內(nèi)被磷酸化。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析也表明，F(xiàn)ANCI在多個絲氨酸殘基位點都有磷酸化，包括先前報道的S557、S560和S566，它們對應(yīng)于在進化中保守的表面暴露殘基。但是，結(jié)合了FANCD2的FANCI與未結(jié)合的FANCI的結(jié)構(gòu)并不相同。作者預(yù)測ATR是在S557、S560和S566位點磷酸化FANCI的激酶。? ? ?

????????為探究已確定的磷酸化位點對FANCD2:FANCI單泛素化的作用，作者進行了磷酸酶處理，然后通過重組FA核心復(fù)合物進行體外泛素化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人和非洲爪蟾的FANCI:FANCD2中，λ-磷酸酶的處理幾乎完全消除了FANCI的單泛素化，并顯著降低了FANCD2的單泛素化速率。作者還發(fā)現(xiàn)，在這些制劑中再加入重組ATR-ATRIP激酶可以恢復(fù)它們的單泛素化水平。結(jié)合特異性磷酸抗體和質(zhì)譜的分析，作者證明了FANCI的三個絲氨酸殘基是ATR激酶的底物，也是FANCI:FANCD2單泛素化所必需的。

????????游離的hFANCI，以及一定程度的hFANCD2也可作為FA核心復(fù)合物單泛素化的底物。作者發(fā)現(xiàn)hFANCI在游離狀態(tài)下更快地被單泛素化，而游離FANCD2則保持非泛素化狀態(tài)。此外，游離FANCI的泛素化速度與ATR-ATRIP處理的FANCI一樣快，但在去磷酸化時它們的泛素化非常緩慢。

研究結(jié)論：FANCI和FANCD2的單泛素化需要FANCI的磷酸化。不管FANCI是否與FANCD2結(jié)合，F(xiàn)ANCI的磷酸化都會特異性地介導(dǎo)其對FANCI的影響。

2.FANCI的S6D擬磷酸突變體與FANCD2結(jié)合的親和力降低

????????除了上述殘基外，還有三個S/TQ殘基被預(yù)測為FANCI中保守的ATR位點。已知S597、S618和S630殘基完全被埋藏在FANCI的螺線管結(jié)構(gòu)中，如果蛋白結(jié)構(gòu)沒有完全展開，任何激酶不可能接近。盡管如此，xFANCI-S6D（6個S突變?yōu)镈的“模擬磷酸化”）和xFANCI-S6A（6個S突變?yōu)锳的“無磷酸化”）突變體隨后被用于假定FANCI的磷酸化導(dǎo)致FANCD2和FANCI解離。然而，作者的體外研究顯示，ATR介導(dǎo)的FANCI磷酸化并沒有導(dǎo)致FANCD2:FANCI異源二聚體解離。然后作者對xFANCI-S6D進行了測試，并確認它與xFANCD2的結(jié)合減少。通過生物層析測定法，作者發(fā)現(xiàn)這是由于xFANCI-S6D與xFANCD2的親和力相對于WT下降了一個數(shù)量級，而xFANCI-S6A與xFANCD2的結(jié)合正常，其親和力與WT相似。

????????在重組ATR-ATRIP磷酸化FANCI蛋白的質(zhì)譜研究中，作者從未觀察到S597、S618和S630的磷酸化，最近的一篇文章也未能在內(nèi)源性人FANCI中發(fā)現(xiàn)這些位點的磷酸化。因此，作者認為S557/S560/S566（3SQ簇）可能是FANCI中的ATR磷酸化功能盒。研究發(fā)現(xiàn)，與xFANCI-S6D不同，每個xFANCI-3SQ突變體都以1:1的比例與xFANCD2結(jié)合。

?研究結(jié)論：ATR激酶對FANCI蛋白表面3SQ簇的調(diào)控不會導(dǎo)致異二聚體的解離，并且可能在FANCD2和/或FANCI單泛素化的調(diào)節(jié)中起著其他作用。

3.FANCI在3SQ簇的磷酸化通過增加FANCI:D2在DNA上的滯留而促進其單泛素化

????????為探究xFANCI在3SQ簇的磷酸化是否影響FANCI:FANCD2的泛素化，作者進行了體外泛素化檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，與WT相比，四個xFANCI的擬磷酸突變體（ADD、ADA、DAD和DDD）的xFANCI:FANCD2復(fù)合體有更高的單泛素化速率。其中，F(xiàn)ANCI-ADD和-DDD突變體的單泛素化速率最高。與之相反，F(xiàn)ANCI-3SQ（AAD和AAA）以及FANCI-6SQ（S6D和S6A）的突變體使得xFANCD2的單泛素化速率比WT更低。

????????先前的研究表明，最佳的FANCI:FANCD2單泛素化需要該復(fù)合物與DNA的結(jié)合。因此作者推測，磷酸化可能會增加FANCI:FANCD2對DNA的親和力。EMSAs的實驗顯示，與對照組相比，λ-磷酸酶處理的FANCI:FANCD2復(fù)合物或FANCI-AAA突變體與DNA的結(jié)合力大大降低。作者進一步測試了游離的FANCI與DNA的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸酶處理也導(dǎo)致其與DNA的結(jié)合減少，而ATR激酶的處理可以恢復(fù)這種結(jié)合。

研究結(jié)論：ATR介導(dǎo)的磷酸化作用使得FANCI（和相關(guān)的FANCD2）對DNA的結(jié)合具有更高的親和力，從而刺激FA核心復(fù)合物對FANCD2的單泛素化。

4.FANCI的磷酸化或擬磷酸化也能保護FANCD2免于去泛素化

????????已發(fā)表的證據(jù)表明，ATR對FANCI的磷酸化也能調(diào)控FANCD2的去泛素化。為了探究USP1:UAF1對FANCI的去泛素化活性是否受3SQ簇的調(diào)控，作者在體外進行去泛素化反應(yīng)。作者在xFANCIub:xFANCD2Ub泛素化后加入λ-磷酸酶處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的xFANCIub在天然狀態(tài)下對去泛素化具有抗性，但去磷酸化加速了它的去泛素化反應(yīng)。此外，xFANCD2Ub的去泛素化速率也明顯更快，而xFANCIub:xFANCD2Ub復(fù)合物的再磷酸化可以減慢USP1:UAF1介導(dǎo)的去泛素化速率。總的來說，當(dāng)與FANCI-ADD或WT-FANCI結(jié)合時，F(xiàn)ANCD2的去泛素化速率比與FANCI-AAA結(jié)合時慢四倍。

研究結(jié)論：ATR介導(dǎo)的FANCI磷酸化既促進了FANCD2的單泛素化，又抑制了FANCD2的去泛素化。

結(jié)論與討論

????????作者的研究表明,ATR對FANCI的直接磷酸化影響了FANCD2的泛素化和去泛素化。因此,FANCI磷酸化的調(diào)控在穩(wěn)定FANCD2的單泛素化中起著雙重作用，這有利于我們進一步了解Fanconi貧血與癌癥的相關(guān)機制。另外，鑒于FANCI作為ATR靶點的重要性， FANCI-3SQ簇的磷酸化狀態(tài)可能是目前正在進行臨床試驗的幾類ATR激酶抑制劑治療癌癥有效性的適當(dāng)生物標志物。

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原文鏈接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00002/full