1.????實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

使用抗原免疫后羊駝PBMC構(gòu)建的噬菌體文庫篩選能特異性結(jié)合抗原的納米抗體序列。

2.????實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過將抗原包被至免疫管，使用構(gòu)建的噬菌體展示文庫對(duì)特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行多輪淘洗篩選，當(dāng)淘洗后的噬菌體達(dá)到合適富集程度后進(jìn)行ELISA驗(yàn)證以排除非特異性序列，最后對(duì)ELISA驗(yàn)證陽性克隆進(jìn)行測(cè)序獲得相應(yīng)納米抗體的序列。

3.????實(shí)驗(yàn)方法與步驟

3.1第一輪篩選

3.1.1從-80℃冰箱中取出篩選抗原，冰上放置解凍；

3.1.2將XX抗原包被免疫管（50μg/管，包被液為CBS，pH9.6，2ml /管），4°C緩慢旋轉(zhuǎn)過夜，同時(shí)平行包被50μg 5% Non-fat milk脫脂奶粉作對(duì)照；

3.1.3將過夜包被的免疫管中的液體棄掉，加入2ml PBS緩沖液室溫清洗免疫管3次，每次旋轉(zhuǎn)5min；

3.1.4加入2ml封閉液（3% PBSTB）溶液，室溫旋轉(zhuǎn)封閉2h；

3.1.5將封閉后的免疫管中液體丟棄，并加入1ml PBS緩沖液室溫清洗免疫管3次，每次旋轉(zhuǎn)5min；

3.1.6棄掉免疫管中的清洗液，加入2ml PBS緩沖液，按照下列公式計(jì)算并加入制備的噬菌體文庫作為第一輪篩選輸入噬菌體文庫，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h：

3.1.7將免疫管內(nèi)液體棄掉，加入2ml PBST（1×PBS加0.1% Tween20，下同）緩沖液室溫清洗免疫管20次，每次旋轉(zhuǎn)5min；

3.1.8將免疫管內(nèi)液體棄掉，盡量去除殘余液體，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室溫旋轉(zhuǎn)洗脫30min；

3.1.9加入10μl 10%AEBSF終止洗脫，將免疫管中的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，即為第一輪篩選噬菌體洗脫液。

3.2第一輪噬菌體洗脫液效價(jià)檢測(cè)

3.2.1將-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固體培養(yǎng)基（Tet抗性）進(jìn)行單菌落劃線，37℃過夜培養(yǎng)（4℃保存一周），從單菌落板上挑取一個(gè)單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；

3.2.2取過夜培養(yǎng)菌液250μl轉(zhuǎn)接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)約45min-60min后至OD600為0.5-0.55；

3.2.3取第一輪噬菌體洗脫液10μl，在1.5ml離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋12個(gè)梯度，即將噬菌體文庫取10μl稀釋至100μl，再從中取10μl稀釋至100μl，依次類推，共稀釋12個(gè)梯度至10-12，振蕩混勻；

3.2.4在每個(gè)稀釋離心管中加入90μl的SS320菌液，混勻后37℃孵育30min；

3.2.5從每個(gè)稀釋離心管中取5μl滴加到2×YT固體培養(yǎng)基（Amp）中，37℃倒置過夜培養(yǎng)；

3.2.6統(tǒng)計(jì)板上可以明顯區(qū)分單菌落的稀釋度的單菌落數(shù)量，并按照下面公式計(jì)算每毫升噬菌體溶液中噬菌粒的數(shù)量，即噬菌體文庫效價(jià)。

3.3第一輪噬菌體洗脫液的擴(kuò)增

3.3.1預(yù)先將-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固體培養(yǎng)基（Tet抗性）進(jìn)行單菌落劃線，37℃過夜培養(yǎng)（4℃保存一周），從單菌落板上挑取一個(gè)單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；

3.3.2取過夜培養(yǎng)菌液250μl轉(zhuǎn)接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)約45min-60min后至OD600值為0.5-0.55；

3.3.3加入500μl第一輪篩選后得到的噬菌體洗脫液至OD600為0.5-0.55的菌液中（剩余的洗脫液4℃保存）；

3.3.3 37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)30 min；

3.3.5將全部菌液均勻涂布到含有100μg/ml Amp和2%葡萄糖的2%瓊脂糖的245mm方形培養(yǎng)基平板中，37℃過夜培養(yǎng)；

3.3.6取過夜培養(yǎng)的方形板，在培養(yǎng)板表面加入6ml 2×YT液體培養(yǎng)基（含10μg/ml Tet），用涂布棒輕輕將方形板菌落刮下并將菌液收集至15ml離心管中，即為擴(kuò)增后的細(xì)菌子文庫，同時(shí)使用分光光度計(jì)測(cè)量菌液OD600值，即為洗脫液細(xì)菌文庫OD600值，加入終濃度為20%的甘油，即為第一輪細(xì)菌文庫。

3.3.7將洗脫液細(xì)菌文庫根據(jù)下面公式計(jì)算出相應(yīng)菌液量，轉(zhuǎn)接至100ml 2×YT液體培養(yǎng)基中（含10μg/ml Tet和100μg/ml Amp），以使初始OD600為0.1：

3.3.8 37℃，250rpm培養(yǎng)直至菌液OD600達(dá)到0.5-0.55；

3.3.9加入輔助噬菌體M13K07以使細(xì)菌個(gè)數(shù)：噬菌體數(shù)=1：20；

3.3.10 37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)30 min；

3.2.11分別加入終濃度為50μg/mlKana和終濃度為0.2μM IPTG，30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。

3.4第一輪噬菌體純化

3.4.1將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中4000 rpm，4 ℃離心10min；

3.4.2將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，加入1/4體積的4℃預(yù)冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混勻后冰上放置30min；

3.4.3 4000 rpm，4 ℃離心20 min，棄上清，并在紙上倒置2min；

3.4.4加入1ml PBS重懸沉淀，將重懸液移至新的1.5ml離心管，12000rpm，4 ℃離心20min；

3.4.5將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管，加入1/4體積預(yù)冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混勻后冰上放置10min；

3.4.6 12000rpm，4 ℃離心10min，棄上清，加入1ml PBS重懸沉淀；

3.4.7 12000rpm，4 ℃離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，即為第一輪篩選噬菌體子文庫，100μl /管分裝，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存

3.4.8第一輪篩選噬菌體子文庫效價(jià)檢測(cè)，方法同3.2。

3.5第二輪篩選

篩選方法同3.1，輸入噬菌體為第一輪篩選得到噬菌體子文庫，作為第二輪篩選輸入噬菌體文庫，得到第二輪篩選噬菌體洗脫液。

3.6第二輪噬菌體洗脫液效價(jià)檢測(cè)

方法同3.2。

3.7第二輪洗脫液的擴(kuò)增、純化

方法同3.3-3.4，得到第二輪篩選噬菌體子文庫。

3.8第二輪篩選噬菌體子文庫效價(jià)檢測(cè)，

方法同3.2。

3.9單克隆ELISA檢測(cè)

3.9.1預(yù)先將-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固體培養(yǎng)基（Tet抗性）進(jìn)行單菌落劃線，37℃過夜培養(yǎng)（4℃保存一周），從單菌落板上挑取一個(gè)單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；

3.9.2取過夜培養(yǎng)菌液250μl轉(zhuǎn)接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)約45min-60min后至OD600值為0.5-0.55；

3.9.3取第二輪篩選后噬菌體洗脫液10μl，在1.5ml離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋12個(gè)梯度，即將噬菌體文庫取10μl稀釋至100μl，再從中取10μl稀釋至100μl，依次類推，共稀釋12個(gè)梯度至10-12，振蕩混勻；

3.9.4每個(gè)稀釋離心管中加入90μl OD600值為0.5-0.55的菌液，混合均勻；

3.9.5 37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)30 min；

3.9.6將菌液均勻涂布到含有100μg/ml Amp的固體培養(yǎng)基平板，37℃過夜培養(yǎng)；

3.9.7從過夜培養(yǎng)后的培養(yǎng)基平板中隨機(jī)挑取單克隆菌落于無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl 2×YT培養(yǎng)基（含有100μg/ml Amp和10μg/ml Tet），37℃過夜靜置培養(yǎng)；

3.9.8取過夜培養(yǎng)的菌液2μl轉(zhuǎn)接至每孔200μl 2×YT液體培養(yǎng)基（含有100μg/ml Amp和10μg/ml Tet）的新96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃靜置培養(yǎng)3h，將轉(zhuǎn)接前過夜培養(yǎng)的菌液4℃保存；

3.9.9按照下面公式計(jì)算并每孔加入輔助噬菌體M13K07以使細(xì)菌個(gè)數(shù)：噬菌體數(shù)=1：20：

3.9.1037℃孵育30 min，加入終濃度為50μg/ml的Kana和0.2μM的IPTG，30℃靜置過夜培養(yǎng)；

3.9.11將過夜培養(yǎng)后的96孔培養(yǎng)板4℃，4000rpm離心10min，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3.9.12將抗原包被酶標(biāo)板（1ng/μl，包被液為CBS，pH9.6，100μl /孔），同時(shí)平行包被BSA作對(duì)照，4°C包被過夜；

3.9.13將過夜包被的酶標(biāo)板內(nèi)液體棄掉，每孔加入200μl PBS緩沖液，室溫清洗酶標(biāo)板3次，每次10min；

3.9.14每孔加入200μl封閉液（3% BSA）封閉酶標(biāo)板，室溫封閉1h；

6.9.15棄封閉液，每孔加入200μL PBST（1×PBS加0.1% Tween20，下同）緩沖液，室溫清洗酶標(biāo)板3次，每次10min；

3.9.16每孔加入120μl 3% BSA后再加入80μl步驟3.6.11中離心后的上清液，室溫孵育2h；

3.9.17棄掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，每孔加入200μlPBST緩沖液洗滌3次，每次10min；

3.9.18每孔加入M13 Bacteriophage Antibody（HRP），Mouse Mab，稀釋于封閉液中，100μl/孔，室溫孵育1h；

3.9.19棄掉ELISA板內(nèi)液體，每孔加入200μlPBST緩沖液洗滌3次，每次10min；

3.9.20每孔加入100μl TMB單組份顯色液，避光顯色2-3min，每孔加入100μl 1M HCl終止，用酶標(biāo)儀讀取OD450值，記錄并保存。

3.10陽性克隆ELISA二次驗(yàn)證

為了排除假陽性結(jié)果，將初步認(rèn)定為陽性克隆進(jìn)行ELISA二次驗(yàn)證，方法同3.9.8-3.9.20。

3.11陽性克隆測(cè)序

根據(jù)ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)和二次驗(yàn)證數(shù)據(jù)選定陽性單克隆

從單克隆ELISA檢測(cè)（3.6.3）板中取陽性克隆菌液5μl接種至2ml 2×YT培養(yǎng)基（含有100μg/ml Amp和10μg/ml Tet），37℃，250 rpm培養(yǎng)直至OD600至0.8-1.0（約6-8h），取1ml菌液測(cè)序，其余菌液4℃保存。

3.12序列分析

經(jīng)測(cè)序的序列使用軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，并使用軟件將抗體序列翻譯成氨基酸。

4.????實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1二輪篩選結(jié)果

富集程度為篩選效價(jià)除于輸入效價(jià)，數(shù)值越高表明抗體在輸入庫中富集程度越高；

相差倍數(shù)為篩選效價(jià)除于對(duì)照效價(jià)，數(shù)值越高表明陽性抗體在篩選庫中含量越高。

當(dāng)相差倍數(shù)大于100-1000倍時(shí)認(rèn)為篩選進(jìn)行ELISA單克隆檢測(cè)。

4.2單克隆ELISA檢測(cè)結(jié)果

免疫管篩選后，隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)，陽性克隆為目的抗原的OD450值大于對(duì)照OD450值3倍且讀值大于0.5。

4.3陽性克隆ELISA二次驗(yàn)證結(jié)果

陽性克隆為目的抗原的OD450值大于對(duì)照OD450值3倍且讀值大于0.5。

4.4序列多樣性結(jié)果

將ELISA二次驗(yàn)證的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列使用GENtle軟件翻譯得到抗體序列，通過序列比對(duì)分析，得到不同的抗體序列。

4.5氨基酸序列

將抗體序列使用GENtle軟件翻譯成氨基酸后，得到抗體序列。