RNA治療是一種基于RNA分子治療或預(yù)防疾病的有效方法。目前，最常見的RNA治療方法是將修飾后的mRNA引入細(xì)胞，mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)并發(fā)揮作用。雖然mRNA療法的治療效果非常強(qiáng)，但它的線性結(jié)構(gòu)使其非常不穩(wěn)定，容易降解。最近的研究表明，一種更穩(wěn)定的RNA分子環(huán)狀RNA(circRNA)可以編碼蛋白質(zhì)，這無疑為RNA治療提供了更好的選擇。

近年來，circRNA被發(fā)現(xiàn)可以編碼功能性小蛋白并發(fā)揮一定的功能。如circSHPRH被發(fā)現(xiàn)編碼146個(gè)氨基酸的蛋白，保護(hù)SHPRH蛋白不被泛素蛋白酶降解[1]。此外，一種由AKT3環(huán)狀RNA編碼的新型腫瘤抑制蛋白(AKT3-174aa)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致瘤性[2]。circRNA的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及其編碼功能蛋白的能力無疑可以在RNA治療中替代線性mRNA的地位。

2023年8月31日，上海海洋大學(xué)徐田軍教授團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Disease（IF=9.0）發(fā)表文章“CircMIB2 therapy can effectively treat pathogenic infection by encoding a novel protein”。作者發(fā)現(xiàn)circMIB2可以通過m6A修飾來翻譯蛋白質(zhì)MIB2-134aa。MIB2-134aa可以與MIB2競爭結(jié)合TRAF6，從而減弱MIB2對(duì)TRAF6的降解作用，增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答，顯著抑制鰻弧菌（V. anguillarum）在斑馬魚體內(nèi)的定殖。與mRNA治療相比，circRNA治療具有免疫原性低、穩(wěn)定性高、療效持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)。作者的研究首次為circRNA療法在經(jīng)濟(jì)魚致病性疾病治療中的應(yīng)用提供了參考。

circMIB2的表征

首先，作者將SCRV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)鮸魚體內(nèi)，通過RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，circMIB2差異表達(dá)并具有編碼潛力。同時(shí)，作者也發(fā)現(xiàn)經(jīng)SCRV病毒和鰻弧菌處理的鮸魚脾臟組織中，circMIB2和MIB2的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。通過瓊脂糖電泳以及RNase R進(jìn)一步驗(yàn)證了circMIB2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。然后作者發(fā)現(xiàn)circMIB2的表達(dá)量在MSpC細(xì)胞中最高，在MIC細(xì)胞中最低。RNA FISH檢測發(fā)現(xiàn)circMIB2主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且被鰻弧菌感染后，circMIB2的含量顯著增加。這些結(jié)果表明circMIB2是一種穩(wěn)定的circRNA，主要表達(dá)并分布于細(xì)胞質(zhì)中（如圖1）。

circMIB2編碼一個(gè)134個(gè)氨基酸(aa)的新蛋白MIB2-134aa

作者通過ORF預(yù)測發(fā)現(xiàn)circMIB2可以編碼一個(gè)134aa的蛋白，并且有一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。將野生型和m6A位點(diǎn)突變的circMIB2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MSpC細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)野生型質(zhì)粒表達(dá)的MIB2-134aa蛋白顯著高于突變型質(zhì)粒，說明circMIB2上可能確實(shí)存在m6A修飾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circMIB2可以編碼蛋白，作者將過表達(dá)circMIB2的質(zhì)粒和體外制備合成的circMIB2分別轉(zhuǎn)染到MIC細(xì)胞內(nèi)，通過LC-MS分析和WB檢測證明circMIB2可以編碼MIB2-134aa蛋白；且IF結(jié)果顯示MIB2-134aa蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。此外，作者還發(fā)現(xiàn)MSpC細(xì)胞在感染SCRV或鰻弧菌的情況下，MIB2-134aa蛋白的表達(dá)會(huì)顯著增加。上述結(jié)果表明circMIB2編碼MIB2-134aa蛋白，該蛋白在SCRV或鰻弧菌感染宿主過程中發(fā)揮了非常重要的作用（如圖2）。

circMIB2和MIB2-134aa促進(jìn)宿主先天免疫

接著，作者設(shè)計(jì)了靶向circMIB2的siRNA并轉(zhuǎn)染到MSpC細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果顯示siRNA可以明顯降低circMIB2的表達(dá)水平，但是不會(huì)影響MIB2 mRNA的表達(dá)。通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circMIB2會(huì)顯著提高ISG15，TNFα和IL-8的表達(dá)水平。結(jié)果表明circMIB2參與了SCRV或鰻弧菌引起的先天免疫應(yīng)答。此外，作者發(fā)現(xiàn)circMIB2的沉默顯著促進(jìn)了SCRV的復(fù)制。采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)一步證實(shí)circMIB2可以顯著抑制鰻弧菌侵襲MIC細(xì)胞。隨后作者通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測了魚類抗病毒和抗菌信號(hào)通路的主要基因，結(jié)果表明，MIB2-134aa主要通過影響TRAF6的活性來促進(jìn)IRF3、ISRE、NF-κB等基因的活性。作者還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染circMIB2后，SCFV感染后CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))顯著降低。綜上所述，MIB2-134aa可通過靶向TRAF6蛋白促進(jìn)TRAF6介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答（如圖3）。

宿主基因MIB2抑制宿主先天免疫

由于MIB2-134aa和MIB2蛋白有兩個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域，因此作者認(rèn)為兩者之間存在一定的聯(lián)系。作者設(shè)計(jì)了針對(duì)MIB2的siRNA，WB和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)si-MIB2明顯降低了MSpC細(xì)胞中MIB2蛋白水平和mRNA水平，并顯著提高TRAF6蛋白表達(dá)水平。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circMIB2會(huì)顯著抑制ISG15，TNFα和IL-8的表達(dá)水平。接著作者通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)MIB2主要通過影響TRAF6的表達(dá)來抑制IRF3、ISRE、NF-κB、IL-1β等基因的活性。此外，MIB2的過表達(dá)顯著促進(jìn)了SCRV的復(fù)制。且在SCRV感染條件下，敲除MIB2后，CPE顯著降低，而轉(zhuǎn)染circMIB2則導(dǎo)致CPE顯著升高。綜上所述，MIB2可以通過促進(jìn)TRAF6蛋白的降解來抑制TRAF6介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，而MIB2-134aa與MIB2具有相反的功能（如圖4）。

MIB2-134aa與MIB2競爭結(jié)合TRAF6來調(diào)控泛素化

為了確定MIB2-134aa和MIB2通過什么途徑調(diào)控TRAF6降解。作者通過WB發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MIB2會(huì)削弱TRAF6蛋白的穩(wěn)定性，而MIB2-134aa的作用正好相反。作者發(fā)現(xiàn)MIB2-134aa與TRAF6以及MIB2與TRAF6之間在細(xì)胞內(nèi)的共定位程度非常高。由此構(gòu)建了MIB2缺失1-132aa質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)TRAF6與MIB2的結(jié)合能力在該結(jié)構(gòu)域被刪除后顯著下降。隨后免疫沉淀證明MIB2與TRAF6或circMIB2與TRAF6均會(huì)發(fā)生相互作用。此外，作者將Flag-MIB2和MIB2-134aa質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MIB2-134aa和MIB2可以競爭結(jié)合TRAF6蛋白。最后，作者發(fā)現(xiàn)在泛素（ubiquitin）野生型和泛素（ubiquitin-K11）突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MIB2介導(dǎo)的TRAF6泛素化顯著增加。綜上所述，MIB2介導(dǎo)k11連接的泛素化，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是MIB2與TRAF6相互作用的關(guān)鍵（如圖5）。

m6A修飾介導(dǎo)circMIB2翻譯蛋白

通過生信預(yù)測，作者發(fā)現(xiàn)circMIB2上不存在IRES序列，只有一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。通過共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明促甲基化酶修飾相關(guān)基因METTL14、METTL16、YTHDF1和YTHDF3能夠顯著提高M(jìn)IB2-134aa蛋白的表達(dá)；而去甲基化酶修飾基因ALKBH5可以顯著降低MIB2-134aa蛋白的表達(dá)。MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)METTL14和METTL16均顯著增加了circMIB2 mRNA的m6A水平。pull down和RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circMIB2可以富集YTHDF1、YTHDF3蛋白，YTHDF1和YTHDF3也能顯著富集circMIB2，但m6A位點(diǎn)突變體circMIB2不能富集YTHDF1、YTHDF3蛋白。綜上所述，circMIB2可以通過m6A修飾介導(dǎo)蛋白質(zhì)的翻譯（如圖6）。

circMIB2可促進(jìn)斑馬魚的先天免疫反應(yīng)并抑制鰻弧菌的定植

作者選擇斑馬魚來驗(yàn)證circMIB2的先天免疫應(yīng)答是否在魚類中具有普適性。將表達(dá)circMIB2的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后注射到斑馬魚腹腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的肝臟、脾臟和腎臟中成功表達(dá)了MIB2-134aa蛋白；并且在注射24h后感染鰻弧菌，circMIB2的表達(dá)量顯著增加。同時(shí)，circMIB2可以顯著促進(jìn)鰻弧菌感染的斑馬魚細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNFα的表達(dá)。此外，作者發(fā)現(xiàn)circMIB2能顯著抑制鰻弧菌在肝臟和脾臟上的定殖。而注射circMIB2的斑馬魚能有效抵抗鰻弧菌的入侵。綜上所述，circMIB2的circRNA治療能顯著抑制鰻弧菌對(duì)斑馬魚的感染，促進(jìn)斑馬魚的先天免疫應(yīng)答（如圖7）。

總結(jié)

本研究在低等脊椎動(dòng)物魚類中發(fā)現(xiàn)了一種來源于E3泛素蛋白連接酶MIB2基因的新型環(huán)狀RNA(circMIB2)，該環(huán)狀RNA可通過m6A修飾轉(zhuǎn)化為134個(gè)氨基酸的蛋白(MIB2-134aa)，并參與先天免疫。MIB2-134aa與宿主基因MIB2蛋白兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列完全一致；宿主基因MIB2可以通過這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域靶向TRAF6，通過促進(jìn)TRAF6的泛素化降解來抑制先天免疫應(yīng)答，而MIB2-134aa的作用則相反。更重要的是，circMIB2治療可以顯著抑制鰻弧菌在斑馬魚體內(nèi)的定殖，這為魚類致病性疾病的治療提供了新的方向。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41419-023-06105-3

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang M, Huang N, Yang X, Luo J, Yan S, Xiao F, et al. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene. 2018;37:1805–14.

[2] Xia X, Li X, Li F, Wu X, Zhang M, Zhou H, et al. A novel tumor suppressor protein encoded by circular AKT3 RNA inhibits glioblastoma tumorigenicity by competing with active phosphoinositide-dependent Kinase-1. Mol Cancer. 2019;18:1–16.