接上一期，今天小編整理一下實驗樣本的獲得，我們按照臨床組織樣本、動物組織樣本、臨床血液樣本、培養(yǎng)細胞樣本等組織類型分別介紹具體獲得細節(jié)及注意事項等。

一、臨床組織樣本獲得

???選取臨床組織的獲取對象需綜合考慮飲食、煙酒習慣、藥物、生物鐘時間規(guī)律等多種影響因素。建議實驗組樣本與對照組樣本的采集狀態(tài)盡量保持一致，以盡可能降低其它未知的因素對于單細胞測序實驗結果的影響。

???建議所取組織塊（如原位腫瘤、癌旁組織、轉移灶等）盡可能有代表性，盡可能去除組織樣本中非研究所需的其它組織，如組織大小推薦為綠豆粒大?。?.2-0.4cm3），濕重約為100-200mg，若組織量較為充裕，建議分割成多個備份樣本，分別保存。

???如條件允許，推薦先用生理鹽水或PBS迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物等可能影響后續(xù)實驗結果的物質。

???為了維持臨床組織樣本中細胞的初始狀態(tài)和活性，在取得新鮮潔凈的臨床組織樣本塊后，盡量保持置于冰上低溫（0-4℃）保存，盡量在2h內進行后續(xù)的單細胞懸液制備實驗。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（單細胞懸液制備方案）。

???如因實驗時間或實驗條件所限，不能立即進行單細胞懸液制備實驗，可選擇將臨床組織樣本（濕重100-200mg，約綠豆粒大小），投入裝有1mL預冷的組織冷藏保存液的離心管中，進行低溫保存和運輸。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（組織樣本的冷藏保存和運輸），建議在24-48小時內進行后續(xù)的單細胞懸液制備和單細胞測序實驗。

二、動物組織樣本獲得

???選取動物組織的獲取對象，需綜合考慮實驗動物的品系、周齡/月齡、性別、飼養(yǎng)條件、健康狀況、實驗表型等多種影響因素。建議實驗組樣本與對照組樣本的采集狀態(tài)盡量保持一致，以盡可能降低其它未知的因素對于單細胞測序實驗結果的影響。

???建議所取組織塊盡可能有代表性（如正常臟器、病患組織、移植瘤等），盡可能去除組織樣本中非研究所需的其它組織，如組織大小推薦為綠豆粒大?。?.2-0.4cm3），濕重約為100-200mg，若組織量較為充裕，建議分割成多個備份樣本，分別保存。

???如條件允許，推薦先用生理鹽水或PBS迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物等可能影響后續(xù)實驗結果的物質。

???為了維持動物組織樣本中細胞的初始狀態(tài)和活性，在取得新鮮潔凈的動物組織樣本塊后，盡量保持置于冰上低溫（0-4℃）保存，盡量在2h內進行后續(xù)的單細胞懸液制備實驗。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（單細胞懸液制備方案）。

?? 如因實驗時間或實驗條件所限，不能立即進行單細胞懸液制備實驗，可選擇將動物組織樣本（濕重100-200mg，約綠豆粒大小），投入裝有1mL預冷的組織冷藏保存液的離心管中，進行低溫保存和運輸。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（組織樣本的冷藏保存和運輸），建議在24-48小時內進行后續(xù)的單細胞懸液制備和單細胞測序實驗。

三、臨床血液樣本獲得

?? 一般選用淡紫色蓋，4mL或6mL規(guī)格的EDTA-K2真空采血管進行采血。

?? 采血對象須在安靜狀態(tài)下取得血液樣本，并綜合考慮飲食、煙酒習慣、藥物、生物鐘時間規(guī)律等多種影響因素。建議實驗組樣本與對照組樣本的采血狀態(tài)盡量保持一致，以盡可能降低其它未知的因素對于單細胞測序實驗結果的影響。

?? 采血操作有創(chuàng)傷性，應嚴格按照無菌技術操作，一人一針一管，防止樣本交叉污染。

?? 采血后，應立即將采血管輕柔的上下充分顛倒混勻5-8次，以使抗凝劑起效。

?? 按上述要求取得的新鮮血液樣本，推薦將采血管垂直放置，置于常溫保存，并在2h內提取外周血單核細胞（PBMC）。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（單細胞懸液制備方案）。

?? 如因實驗時間或實驗條件所限，不能立即進行單細胞測序實驗，在提取到狀態(tài)良好的PBMC細胞后，可選擇將適量的PBMC細胞（約5×105個），重懸于1mL細胞冷凍保存液中，并轉移入2mL外螺旋式細胞凍存管中，程序降溫至-80℃，最終長期保存于液氮中。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（細胞樣本的冷凍保存和運輸），建議在4周內復蘇細胞樣本并進行后續(xù)的單細胞測序實驗。

四、培養(yǎng)細胞樣本獲得

???貼壁細胞：選取培養(yǎng)狀態(tài)良好的貼壁細胞，吸去細胞培養(yǎng)基，加入1mL?PBS潤洗兩次，加入適量0.25%的Trypsin-EDTA酶解液，置于37°細胞CO2培養(yǎng)箱中靜置消化1-2min。顯微鏡下觀察到細胞邊緣收縮、開始從培養(yǎng)皿解離。用手輕輕拍打培養(yǎng)皿側邊緣，使解離的細胞呈“流沙狀”滑落，立即加入至少5倍體積的完全培養(yǎng)基中止消化。隨后將細胞懸液輕柔吹打混勻，轉入15mL離心管中，室溫離心300×g，5min。吸去上清，用10mL PBS重懸清洗細胞，共重復清洗兩次即可。

???懸浮細胞：選取培養(yǎng)狀態(tài)良好的懸浮細胞，直接將細胞懸液輕柔吹打混勻，一起轉入15mL離心管中，室溫離心300×g，5min。吸去上清，用10mL PBS重懸清洗細胞，共重復清洗兩次即可。

???為了維持培養(yǎng)細胞的初始狀態(tài)和活性，在取得狀態(tài)良好的培養(yǎng)細胞后，應保持將樣本置于冰上低溫（0-4℃）保存，盡量在2h內進行后續(xù)的單細胞懸液制備實驗。

???如因實驗時間或實驗條件所限，不能立即進行單細胞測序實驗，可選擇將適量的培養(yǎng)細胞（約5×105個），重懸于1mL細胞冷凍保存液中，并轉移入2mL外螺旋式細胞凍存管中，程序降溫至-80℃，最終長期保存于液氮中。詳細操作步驟參見后續(xù)章節(jié)（細胞樣本的冷凍保存和運輸），建議在4周內復蘇細胞樣本并進行后續(xù)的單細胞測序實驗。