先天免疫接頭蛋白是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，上游受體通過接頭蛋白激活促炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致宿主清除病原體。細(xì)菌病原體已經(jīng)發(fā)展出在宿主細(xì)胞內(nèi)生存而不觸發(fā)先天免疫監(jiān)視的策略，但其方式仍不清楚。2023年10月23日，南方科技大學(xué)附屬第二醫(yī)院楊亮團(tuán)隊(duì)在

《

Advanced Science

》（IF=15.1）

發(fā)表了題為“A Bacterial Quorum Sensing Regulated Protease Inhibits Host Immune Responses by Cleaving Death Domains of Innate Immune Adaptors”的研究成果，該研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證揭示了綠膿桿菌在巨噬細(xì)胞吞噬后誘導(dǎo)其群體感應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群體感應(yīng)通過直接切割免疫接頭調(diào)節(jié)細(xì)胞先天免疫抑制。

青蓮百奧為該研究提供蛋白質(zhì)組學(xué)檢測和分析服務(wù)。

巨噬細(xì)胞吞噬后綠膿桿菌誘導(dǎo)群體感應(yīng)機(jī)制

為了鑒定綠膿桿菌被宿主免疫細(xì)胞吞噬后新合成的蛋白，作者采用pulsed-SILAC蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分別用L-lysine-13C6 15N2 (Lys8)和L-lysine (Lys0)標(biāo)記進(jìn)入宿主細(xì)胞前后的細(xì)菌蛋白質(zhì)組。通過使用這種脈沖標(biāo)記方法，多達(dá)196種蛋白質(zhì)被確定為細(xì)胞內(nèi)特異性新合成蛋白質(zhì)。這些蛋白按功能分組，在4小時(shí)的感染過程中，一系列毒力相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成，包括眾所周知的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子LasR。 為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞吞噬后綠膿桿菌最后群體感應(yīng)(QS)機(jī)制的激活，作者接下來研究了最后群體感應(yīng)報(bào)告系統(tǒng)是否在細(xì)胞內(nèi)感染中確實(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，綠膿桿菌在巨噬細(xì)胞吞噬后積極表達(dá)其群體感應(yīng)機(jī)制，從而可能分泌大量群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的毒力產(chǎn)物，從內(nèi)部調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能。

圖1 綠膿桿菌在巨噬細(xì)胞吞噬后誘導(dǎo)群體感應(yīng)機(jī)制

綠膿桿菌分泌抑制先天免疫信號通過猝滅激活的細(xì)胞質(zhì)先天免疫接頭

QS系統(tǒng)控制多種毒力因子的表達(dá)，包括鼠李糖脂、凝集素、毒素、蛋白酶，如彈性酶B (LasB)、蛋白酶IV (PIV)和彈性酶a (LasA)。MyD88是先天免疫應(yīng)答中重要的適配蛋白，在對綠膿桿菌感染的識別和應(yīng)答中起重要作用。巨噬細(xì)胞是一種在檢測和消除感染中起核心作用的免疫細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞的背景下，MyD88通過toll樣受體(TLRs)參與介導(dǎo)對綠膿桿菌的反應(yīng)。當(dāng)綠膿桿菌被TLR4識別后，TLR4受體復(fù)合體招募MyD88。MyD88作為一種適配蛋白，促進(jìn)其他蛋白的募集和激活，包括IRAK(白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶)家族成員在識別綠膿桿菌TLR4受體復(fù)合物募集MyD88。IRAK蛋白的激活觸發(fā)一系列磷酸化事件和蛋白-蛋白相互作用，最終導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活。這些轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，如促炎細(xì)胞因子和趨化因子。作者進(jìn)一步用BG-647標(biāo)記MyD88死亡結(jié)構(gòu)域（DD），用BG-488標(biāo)記IRAK2-DD種子，通過檢查IRAK2的緩慢遷移，推斷出哪個(gè)MyD88DD是活躍的。通過對綠膿桿菌和其他11種不同細(xì)菌的分泌物的篩選，發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌的分泌抑制了MyD88 DD和含有CSRD的細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）的寡聚。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，信號抑制是通過切割免疫適配器的死亡結(jié)構(gòu)域。

圖2?綠膿桿菌分泌抑制先天免疫信號通過淬滅激活的細(xì)胞質(zhì)先天免疫適配器

綠膿桿菌分泌的先天免疫抑制因子的生化特性

綠膿桿菌分泌物混合物與MyD88 DD復(fù)合物孵育，發(fā)現(xiàn)緩沖條件的改變對先天免疫抑制活性有顯著影響。SDS-PAGE分析顯示，這些條件破壞了實(shí)驗(yàn)中觀察到的裂解活性，表明抑制劑是離子依賴性的，對極端pH環(huán)境敏感。此外，MyD88 DD的裂解具有時(shí)間依賴性，可以在反應(yīng)的較早時(shí)間點(diǎn)通過熱處理進(jìn)行淬滅。通過SEC和離子交換，成功分離出兩個(gè)有助于MyD88 DD降解活性的組分。通過胰蛋白酶輔助質(zhì)譜分析，確認(rèn)該酶的身份是LasB，這是綠膿桿菌的一種著名的由群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的毒力產(chǎn)物。

圖3?綠膿桿菌分泌的先天免疫抑制因子的生化特性及純化

單LasB對綠膿桿菌分泌的先天免疫抑制活性起作用

lasB缺陷菌株(ΔlasB)的分泌物不能破壞MyD88信號在體外的傳播，而lasB的補(bǔ)充恢復(fù)了表型。MyD88 DD過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞通過NF-κB熒光素酶報(bào)告基因檢測進(jìn)行評估顯示，40 nM的LasB足以使MyD88 dd誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減少一半。胰蛋白酶控制表明LasB的蛋白水解活性對先天免疫蛋白具有特異性。如果將LasB與血清成分預(yù)先孵育或熱處理，這種免疫抑制活性就消失了，這表明有必要將折疊良好的LasB直接送入宿主細(xì)胞以抑制先天免疫反應(yīng)。此外，陰性染色電鏡(EM)實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化的預(yù)活化MyD88低聚物被LasB消化成無活性片段。因此，LasB直接消化先天免疫適配器，從而抑制免疫反應(yīng)。此外，與其他先天免疫適配蛋白相比，MyD88形成相對較小和靈活的結(jié)構(gòu)，這可能使其更容易受到蛋白酶的抑制。

圖4?LasB單獨(dú)負(fù)責(zé)綠膿桿菌分泌的先天免疫抑制活性

LasB抗炎特性的結(jié)構(gòu)論證

對幾種M4家族肽酶底物結(jié)合袋周圍的氨基酸序列比對顯示出高度的序列相似性。這使得很難確定LasB能夠降解宿主細(xì)胞中的死亡域接頭的原因。利用以往積累的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，作者比較了這些LasB同源物的活性位點(diǎn)袋的三維結(jié)構(gòu)。LasB在所比較的所有同源物中具有最寬的底物結(jié)合槽，頸距為6.9 ?。更大的開口將賦予這種鋅金屬蛋白酶適應(yīng)α螺旋的剛性環(huán)或轉(zhuǎn)折點(diǎn)的能力，這是死亡結(jié)構(gòu)域中潛在的切割位點(diǎn)。在LasB催化袋附近引入了輕微的點(diǎn)突變，略微縮小了底物結(jié)合槽的頸部距離。所有三個(gè)突變體(H223Y、A113S和V137L)都將溝槽縮小了0.6-0.8 ?，這種擾動足以顯著破壞LasB消化MyD88 DD的酶活性。

圖5?LasB抗炎特性的結(jié)構(gòu)論證

MyD88 DD在A24L25位點(diǎn)被LasB切割，這是穩(wěn)定活性信號低聚物界面所必需的

采用質(zhì)譜分析方法鑒定LasB酶切后的肽片段，發(fā)現(xiàn)A24L25也符合LasB底物偏好的一般預(yù)測，開始成為最可能的裂解位點(diǎn)。該基序位于MyD88 DD的第一個(gè)α-helix的扭結(jié)處，使其更容易被外部因素訪問。同時(shí)，這個(gè)潛在暴露的基序?qū)τ诜€(wěn)定多聚體MyD88復(fù)合物非常重要，這對于TLR信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。在重組實(shí)驗(yàn)中，與野生型MyD88-DD相比，MyD88 DD (A24S)明顯抵抗LasB消化。平行控制突變體(G106D)不賦予MyD88 DD這種保護(hù)。在細(xì)胞熒光素酶實(shí)驗(yàn)中，MyD88野生型和A24S突變體在HEK239T細(xì)胞中過表達(dá)，當(dāng)純化的≈40-50 nM LasB電穿孔到細(xì)胞中時(shí)，MyD88 (A24S)比野生型構(gòu)建體更能抵抗免疫抑制。

圖6?MyD88 DD在A24L25位點(diǎn)被LasB切割

LasB在綠膿桿菌胞內(nèi)感染過程中表達(dá)和分泌

抗flag免疫印跡顯示LasB在宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積極分泌。腺苷酸環(huán)化酶(Cya)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)了LasB的分泌Cya2-400報(bào)告結(jié)構(gòu)域被融合到全長LasB蛋白的C端。將編碼LasB融合蛋白和Cya2-400結(jié)構(gòu)域的基因插入到phd20t質(zhì)粒中，編碼這些蛋白的基因由LasB啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。感染產(chǎn)生LasB-Cya融合的綠膿桿菌導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)RAW 264.7 cAMP水平急劇增加。相比之下，感染單獨(dú)產(chǎn)生Cya的綠膿桿菌不影響cAMP水平。

圖7?在綠膿桿菌的機(jī)會性細(xì)胞內(nèi)感染過程中，LasB被分泌并活躍

LasB降解巨噬細(xì)胞MyD88并降低TNF-α水平

分別用PAO1、ΔLasB和LasB補(bǔ)體菌株感染RAW264.7細(xì)胞，并通過western-blotting分析細(xì)胞內(nèi)MyD88的水平。與PAO1和補(bǔ)體菌株相比，感染ΔlasB菌株后細(xì)胞內(nèi)MyD88水平升高。MyD88靠近TLR復(fù)合體，下游信號也被檢查。Western blot數(shù)據(jù)顯示，與ΔlasB突變體相比，PAO1減弱了NF-κB的p65亞基的磷酸化，而對ERK、JNK、p38的磷酸化沒有影響。進(jìn)一步測定了TNF-α的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)與PAO1和補(bǔ)體菌株相比，ΔlasB菌株的TNF-α水平顯著升高。

圖8?LasB降解巨噬細(xì)胞中的MyD88，降低TNF- α水平

研究結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，作者觀察到綠膿桿菌能夠在吞噬巨噬細(xì)胞后存活，并通過代謝標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法誘導(dǎo)群體感應(yīng)機(jī)制。然后采用重組方法分離出能夠在受體-適配器階段淬滅宿主免疫信號的細(xì)菌因子。在篩選細(xì)菌分泌組后，發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)產(chǎn)物L(fēng)asB可以消化和阻止多種先天免疫受體的寡聚化，從而在它們的機(jī)會性細(xì)胞內(nèi)感染期間沉默免疫反應(yīng)。該研究認(rèn)為LasB和其他相關(guān)的細(xì)菌蛋白酶在慢性細(xì)胞感染的建立中發(fā)揮了重要作用。此外，該研究還揭示了細(xì)菌蛋白酶如何降解和去除宿主細(xì)胞中的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白寡聚物，從而幫助細(xì)菌逃避先天免疫反應(yīng)的機(jī)制。 【參考文獻(xiàn)】 Duan X, Boo ZZ, Chua SL?et al. A Bacterial Quorum Sensing Regulated Protease Inhibits Host Immune Responses by Cleaving Death Domains of Innate Immune Adaptors. Adv Sci (Weinh). 2023 Oct 23:e2304891.?